Protocolo de Estudos de Extinção do medo condicionado em Naturally Ciclismo ratas
Summary
Gonadal hormones such as estrogen modulate memory formation in a number of experimental paradigms including fear extinction memory. This protocol describes a set of methods for investigating the influence of gonadal hormones specifically during extinction in naturally cycling females, including estrous cycle monitoring and exogenous estrogen administration.
Abstract
A extinção do medo condicionado tem sido extensivamente estudada em roedores machos. Recentemente, tem havido um número crescente de estudos que indicam que os mecanismos neurais para certas tarefas comportamentais e comportamentos de resposta são diferentes em fêmeas e machos. Usando fêmeas em estudos de pesquisa pode representar um desafio por causa da variação de hormônios sexuais durante o ciclo estral. Este protocolo descreve procedimentos bem estabelecidos que são úteis para investigar o papel do estrogénio na extinção medo a consolidação da memória em ratos fêmeas. Fase do ciclo estral e administração de estrogênio exógeno antes do treino extinção pode influenciar recordação extinção 24 horas mais tarde. A técnica de swab vaginal para identificação fase de estro descrito aqui ajuda o exame e manipulação de ciclismo naturalmente hormônios sexuais. O uso deste modelo básico roedor pode delimitar melhor os mecanismos pelos quais o estrogênio podem modular memória extinção do medo emfêmeas.
Introduction
Diferenças sexuais inerentes são observados em vários comportamentos cognitivos e paradigmas de aprendizagem em humanos e roedores. Por exemplo, foi relatado que as mulheres geralmente têm habilidades verbais e orientada para o detalhe mais fortes, enquanto os homens têm melhores habilidades espaciais 1-3. Estas diferenças entre os sexos pode ser em parte devido à influência dos hormônios sexuais. Altos níveis de estradiol melhorar o desempenho em tarefas em que as mulheres são melhores, mas pioram o desempenho em tarefas que os homens geralmente fazem bem 4-6. Embora esta evidência é convincente, a capacidade limitada de controlar completamente ambientes experimentais em estudos humanos torna difícil determinar se esses efeitos sobre o comportamento pode ser atribuído especificamente aos hormônios. Os estudos em animais, em contraste, permite a circunstâncias totalmente controladas.
Embora os mecanismos neurais básicos de extinção do medo, foram identificados e são bem estudada em machos, não é claro seestes sistemas são os mesmos em fêmeas ou como eles mudam ao longo do ciclo estral. O condicionamento do medo e extinção são amplamente utilizados paradigmas comportamentais em roedores e humanos para realizar estudos relacionados a transtornos de ansiedade. Dado que as mulheres têm um maior risco de transtornos de ansiedade, bem como a duração dos sintomas e a gravidade maior 7-13, é crítico para incluir fêmeas nestes estudos. A sub-representação das mulheres na pesquisa pode ser atribuída aos desafios de monitoramento fase de estro e contábil para os efeitos comportamentais de hormônios sexuais. Laboratórios que fazem examinar fêmeas nesta problemas encontro em conta que muitas vezes passam não declarada ou não estão descritos nos métodos para seus estudos.
Emergentes evidência em roedores sugere que as diferenças sexuais em extinção do medo são modulados por hormonas sexuais 14-18. Com medo condicionado, os animais são treinados para temer um estímulo particular. Depois de uma série de apresentações de unreinforcedo estímulo, os animais aprendem a não temer a sugestão, um processo chamado de extinção. Como bem o animal aprende e consolida a memória de aprender esta tarefa pode ser observado durante um teste de recordação extinção dado algum tempo após o treinamento extinção. Menos expressão medo durante a chamada extinção demonstra boa consolidação da memória extinção. Descobertas recentes de nosso laboratório sugerem que o estrogênio pode modular a consolidação da memória de extinção do medo e melhorar a recordação extinção. Especificamente, os ratos fêmeas que são extintas em proestro, a fase do ciclo estral, durante o qual os níveis circulantes de estrogênio pico, apresentam uma melhor retenção de memória extinção. Em contraste, as mulheres que se extinguem no visor fase metaestro baixo estrogênio relativamente pobre recordação extinção, o que pode ser melhorado com a administração de estradiol exógeno antes ou imediatamente após o treino extinção 15,16. Os mecanismos neurais da extinção consolidação da memória (including o papel dos hormônios sexuais) em fêmeas não são claras.
Em animais de laboratório, o papel dos hormônios pode ser investigado utilizando procedimentos de remoção cirúrgicos invasivos, como a castração e ooforectomia. Após a recuperação da cirurgia, os hormônios sexuais são frequentemente exogenamente manipulada durante a realização de uma tarefa comportamental 19. Esta abordagem tem fornecido informações importantes sobre os hormônios sexuais e é útil porque permite manipulações bem controlados de hormônios sexuais (em termos de tempo e dose) 20-23. Esta abordagem, no entanto, não se avaliar a influência das flutuações naturais que ocorrem em todo o ciclo estral nem representam animais "normais", limitando assim o potencial de translação para estudos em seres humanos. Tem sido bem documentado que os níveis das hormonas sexuais femininas pico e declínio em fases específicas do ciclo estral, e as alterações de expressão de receptor de estrogénio no ciclo, ae 24 após a ovariectomia. Assim, existe a necessidade de realizar estudos sobre as fêmeas com gônadas intactas e refinar modelos experimentais para estudar com segurança os efeitos que os estados altos e baixos de estrogênio pode ter sobre as mulheres ao longo da sua vida útil.
Este protocolo incide sobre o efeito do estrogênio sobre os sistemas neurobiológicos envolvidos na extinção do medo. Ele descreve como: 1) monitorar cuidadosamente o ciclo estral, 2) preparar as doses eficazes de estradiol para administração sistêmica, e 3) seguem um paradigma comportamental que inclui o condicionamento do medo, extinção, e recordar na naturalmente ciclismo ratas. Este protocolo pode ser modificado com outras manipulações farmacológicas e ferramentas celulares e moleculares para auxiliar estudos para compreender melhor as diferenças de sexo que são observados no medo condicionado comportamento extinção. Note-se que os procedimentos descritos abaixo são aqueles utilizados no nosso laboratório, e existe uma série de variações destes procedimentos in literatura.
Protocol
Representative Results
Discussion
Extinção do medo tem sido extensivamente estudada em ratos machos com os mecanismos neurais que medeiam extinção medo condicionado identificados e avaliados sob várias manipulações. Relativamente poucos estudos analisaram ratas ou o papel das hormonas sexuais na extinção do medo. Para estudar especificamente os efeitos do estrogénio sobre a extinção do medo, naturalmente ciclagem ratas são submetidos a um paradigma comportamental de três dias. Este procedimento consiste em fases habituação / condicionado…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Mohammed R. Milad is supported by NIMH grant R01 MH097880 and institutional funds from the Department of Psychiatry at MGH.
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Fear conditioning chamber | Coulbourn Instruments | ||
| Graphic State | Coulbourn Instruments | ||
| Sound-attenuating box | Med Associates, Inc. | NIR-022MD | |
| Estradiol | Sigma-Aldrich | E1024 | In sesame oil for subcutaneous injection |
| Sesame oil | Sigma-Aldrich | S3547-250ML | |
| Freezescan | Cleversys, Inc. | ||
| Dip quick stain | Jorgensen Laboratories, Inc. | J0322A1, J0322A2, J0322A3 | |
| Cotton-tipped applicators | Fisher Scientific | 23-400-114 | 6-inch, sterile |
| 0.9% saline | LabChem, Inc. | LC23460-2 | Sodium chloride w/v |
| Selectfrost microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-003 | |
| Virex II 256 | Diversey, Inc. | 5019317 | Dilute 1:256 with water |
| Luer-Lok Tip 1ml Syringes | Becton Dickinson | 309628 | |
| Hypodermic disposable needles | Exelint International, Co. | 26402 | 26-gauge |
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