تطوير<em> في المختبر</em> نظام نموذجي لدراسة تفاعل<em> ايكوس</em><em> الحصانية</em> إيج مع مستقبلات لها عالية تقارب FcεRI
Summary
The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine FcεRIα gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.
Abstract
The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (FcεRI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and FcεRI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine FcεRIα was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine α-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat β- and γ-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine FcεRIα transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using β-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% ± 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.
Introduction
وقد عرفت الحساسية لآلاف السنين. ووصف علاج الربو في النص الطبية المصرية القديمة المعروفة باسم بردية إبيرس (~ 1550 قبل الميلاد) وناقش العلاجات العشبية لعلاج النتيجة 7.
وتصنف الحساسية اليوم كرد فعل فرط الحساسية من النوع الأول، حيث T نوع من الخلايا المساعد 2 (TH 2) ذراع الجهاز المناعي يرسم إنتاج الغلوبولين المناعي E (IgE و) الأضداد استجابة لمستضدات البيئية تسمى المواد المسببة للحساسية. هذه هي المواد المتنوعة التي تتفاعل عادة مع الخلايا في جهاز المناعة، وتحفيز تخليق وإفراز السيتوكينات الموالية للالتهابات، بما في ذلك انترلوكين 4 وانترلوكين 13 8، 9 كما لم الجسيمات في دخان السجائر أو جزيئات عادم الديزل التي تعزز إيج التوليف 10.
ويعزى الارتفاع في مظاهر الحساسية في البلدان الصناعية في السنوات ال 50 الماضية لمزيج من تأثيرالملوثات البيئية والاتجاه إلى بيئة أكثر مطهرة، والتي تتضافر لتحول الاستجابة المناعية تجاه لمحة سادت قبل TH 2 السيتوكينات، على النحو الذي اقترحه "فرضية النظافة" 11.
كما ذكر أعلاه، والبشر ليسوا الثدييات الوحيدة التي تعاني من الحساسية. وخاصة الخيول والكلاب ويمكن أيضا تطوير استجابات حساسية الكلاسيكية وأظهرت دراسة أجرتها أن 12، كما هو الحال في البشر، ويعزى الحساسية الخيول إلى العوامل الوراثية والبيئية. ونتيجة لذلك، فإن هذه الحيوانات تمثل نماذج جيدة لدراسة التفاعل بين الأسباب الوراثية والبيئية للحساسية، تقدمه من توعية لمرض، واستراتيجيات التدخل الممكنة مرة واحدة وضعت في المظاهر السريرية
في عام 1887، كان أول شخص Stömmer لوصف التشابه بين الإنسان والربو الخيلي 13، وتأثير الهستامين على نظام القلب والأوعية الدموية الخيول هومشابهة جدا لتلك التي للبشر 14. الخيول هي أيضا حجر الزاوية في صناعة سباقات الخيل، الذي يستحق 72 مليار دولار مع الرهان دوران من 115 مليار دولار سنويا 15.
معظم خيول السباق المعاصرة هي من نسل عدد قليل من الخيول العربية ولدت من قبل السيدة آن بلنت من عام 1878 فصاعدا. والفطرية السباق الحديثة عادة لتحديد لقدرات الأداء. هم عرضة للاضطرابات وراثية، واحدة منها هي قابليتها لتركيب استجابات حساسية. لديهم أيضا 1000 مرة أعلى من المصل مستويات إيج حتى الأكثر حساسية شديدة البشر 16. وعادة ما تتجلى الحصان استجابات حساسية مثل فرط الحساسية لدغة حشرة (IBH) 17، 18. IBH النتائج في التهاب الجلد بسبب لدغات الحشرات تشكل في جنس البعضوضيات. شكل آخر من أمراض الحساسية الخيول هو انسداد لمجرى الهواء المتكررة (راو)، وهذا يتجلى في الرئتين والشعب الهوائية. ويتميز هذا الصفير ومختبرored التنفس. راو يحدث عادة استجابة لجراثيم العفن، وسجلت حساسية عالية خاصة بمستويات IgE في الخيول التي تعاني من راو في دراسة واحدة 19 على الرغم من تحقيق آخر لم يؤكد هذا 20.
تدور دراسات عن حساسية الخيول حول محاولة لرصد وتحييد الخيول إيج من خلال تطوير إيج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة المضادة للالفروسية (MABS) 21، 22. وعلاوة على ذلك الدراسة بنسبة 23 تناقش إنتاج المجالات خارج الخلية من α من الخيول عالية تقارب-FC مستقبلات ل سلسلة (FcεRIα) مستقبلات في محاولة لكشف وquantitate مصل الخيول إيج. تناقش دراسة ذلك من قبل لدين 24 نهج جديد يهدف إلى تحييد إيج المصل بواسطة فتيلة الجهاز المناعي باستخدام مستمنع الذات / غير المتمتعة بالحكم الذاتي. كل هذه الدراسات، ومع ذلك، تفتقر مقايسة فعالة لاختبار سلامة وفعالية بروتوكولاتها. في هذه المقالة، ونحن الآن تقديم مثل هذا الفحص SYSتيم ينطبق على دراسة الاستراتيجيات التشخيصية والعلاجية ذات الصلة لنظام الفروسية، حيث الإفراج β-هيكسوزامينيداز، كمؤشر الوسيط خلية تحبب، تم تقييمها على الخلايا ربل-2H3.1 معربا عن فرسي FcεRIα. ويعتمد هذا البروتوكول على المنشورات السابقة 25، 4، 5، 2، 3 اصفا الهندسة خلايا RBL transfected مع الجينات ترميز المجال الجلوبيولين ملزمة لمستقبلات عالية تقارب لفريق الخبراء الحكومي الدولي من مختلف الأنواع. ويوضح البروتوكول كيفية تنفيذ بيان فحص β-هيكسوزامينيداز، وتعرض نتائج التي كما يعني ± الانحراف المعياري للتجارب ثلاث نسخ.
وقد تم تطوير هذا الفحص من خلال إطلاق أول Siraganian وهوك 25 لدراسة الحساسية الإنسان. كما وضعت المجموعة المختبر بقيادة الدكتور روبن Siraganian خط الخلية ربل. وقد وضعت هذه الخلايا ربل للتعبير عن FcεRIα البشرية ونشر بروتوكول بنسبة 4. الجزء الاخيروجاء الفحص مع وضع البلازميد ايندهوفن في الورقة التي نويبيرغر 26 التي وصفت إنتاج من الأجسام المضادة عن طريق الاستنساخ في سلسلة الجينات الثقيلة الخارجة من الجين الماوس لمنطقة متغيرة إيج التي تستهدف ناشبة 4-هيدروكسي-3 -nitro-phenacetyl (NP)، فإن الأجسام المضادة الناتجة خيالية وظيفية بالكامل. القدرة على تطوير أي فريق الخبراء الحكومي الدولي التي تستهدف نفس ناشبة، بينما الاستنساخ أيضا مستقبلات على سطح الخلايا ربل أدى إلى توحيد الفحص مما يجعل من بروتوكول مفيد لقياس تحبب الخلايا قعدة.
مقايسة لديه إيجابيات وسلبيات. الايجابيات من الفحص هو قدرتها على التكيف لاستخدامها في أي نظام الثدييات، وبالتالي تستخدم المختبر لاختبار للتحبب في النظم البشرية والكلاب والخيول، وهذا أمر يمكن تحقيقه ببساطة عن طريق تجميع فريق الخبراء الحكومي الدولي الكائن الحي واستنساخ مستقبله على سطح الخلايا ربل.
من ناحية أخرى،سلبيات الفحص هو أن خلايا RBL حساسة جدا للتغيرات الحرارية والميكانيكية ودرجة الحموضة، مما يجعلها تعطي تباين مستويات تحبب داخل نفس الفحص. وبالتالي ينصح بشدة أن المقايسات وتتكرر دائما في يثلث ثم يؤخذ بمعدل منها. وعلاوة على ذلك، فإن الخلايا ربل تميل إلى التحول نحو النمط الظاهري غير الإفراج إذا ما تركت في زراعة الأنسجة لمرات طويلة (> 10 أسبوعا) 27، مما يجعل صيانتها مرهقة. هم أيضا عرضة للعدوى من البكتيريا الميكوبلازما، والتي هي غير مرئية من الضوء والمجهر لا تغيير مورفولوجيا الخلية، ولكن من شأنه أن يغير بشكل جذري مستويات تحبب لهم. وبالتالي هناك حاجة إلى اختبارات الميكوبلازما العادية.
Protocol
Representative Results
Discussion
في ملخص أظهرت نتائج هذا التحقيق أنه عندما يتم توعية خلايا RBL-2H3.1 معربا عن FcεRIα مع فرسي فرسي إيج وتحدى من قبل المستضد، فإنها تعطي بيان الذروة سيط 36.68٪ ± 4.88٪ من المبلغ الإجمالي الوسيط داخل الخلايا، مقارنة مع ربل-2H3.1 الخلايا الأبوية لا تعبر عن فرسي FcεRIα.
<p class="jove_content" style="…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Lynda Partridge for the provision of advice and laboratory facilities.
Materials
| RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα | – | – | Produced in the lab |
| Equine IgE anti NIP-HSA | – | – | Produced in the lab |
| 96 Well Plate | Sigma | CLS3595 | – |
| Multi Channel Pipette | Anachem | – | – |
| Incubator | Galaxy R | – | – |
| 4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid | Cambridge Research Biochemicals | N-1070-1 | NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab |
| Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin | Sigma | A6661 | Abbreviated DNP-HSA |
| Plate Spectrophotometer | Anthos Labtec HT2 | – | – |
| Pipes | Sigma | P1851 | – |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | – |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | – |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | – |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | – |
| Triton x100 | Sigma | X100 | – |
| 4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | N9376 | Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | – |
| Citric Acid | Sigma | 251275 | – |
| Sodium Acetate | Sigma | S7670 | – |
| Tris | Sigma | T5941 | – |
References
- Taudou, G., et al. Expression of the Alpha Chain of Human FcεRI in Transfected Rat Basophilic Leukemia Cells: Functional Activation after Sensitization with Human Mite-Specific IgE. Int Arch Allergy Immunol. 100 (4), 344-350 (1993).
- Sabban, S. . Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity FcεRI Receptor. , (2011).
- Sabban, S., Ye, H., Helm, B. A. Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity Receptor FcεRI. Vet ImmunolImmunopathol. 153 (1-2), 6-10 (2013).
- Wilson, A. P. M., Pullar, C. E., Camp, A. M., Helm, B. A. Human IgE mediates stimulus secretion coupling in rat basophilic leukemia cells transfected with the a chain of the human high-affinity receptor. Eur J Immunol. 23, 240-244 (1993).
- Hunter, M. J., Vratimos, A. P., Housden, J. E. M., Helm, B. A. Generation of canine-human Fc IgE chimeric antibodies for the determination of the canine IgE domain of interaction with FcεRIα. MolImmunol. 45 (8), 2262-2268 (2008).
- Rashid, A., et al. Review: Diagnostic and therapeutic applications of rat basophilic leukemia cells. MolImmunol. 52 (3-4), 224-228 (2012).
- Cohen, S. G. Asthma in antiquity: the Ebers Papyrus. Allergy Proc. 13 (3), 147-154 (1992).
- Dudler, T., et al. A link between catalytic activity, IgE-independent mast cell activation, and allergenicity of bee venom phospholipase A2. J. Immunol. 155, 2605-2613 (1995).
- Machado, D. C., Horton, D., Harrop, R., Peachell, P. T., Helm, B. A. Potential allergens stimulate the release of mediators of the allergic response from cells of mast cell lineage in the absence of sensitization with antigen-specific IgE. Eur J Immunol. 26 (12), 2972-2980 (1996).
- Smyth, L. J., et al. Assessment of the molecular basis of pro-allergenic effects of cigarette smoke. Environ Sci Technol. 34 (7), 1370-1374 (2000).
- Okada, H., Kuhn, C., Feillet, H., Bach, J. F. The ‘hygiene hypothesis’ for autoimmune and allergic diseases: an update. ClinExpImmunol. 160 (1), 1-9 (2010).
- Eder, C., et al. Influence of environmental and genetic factors on allergen-specific immunoglobulin-E levels in sera from Lipizzan horses. Equine Vet J. 33 (7), 714-720 (2001).
- Cook, W. R., Rossdale, P. D. The syndrome of ‘Broken Wind’ in the horse. Proceedings of the Royal Society of Medicine. 56, 972-977 (1963).
- Eyre, P., Lewis, A. J. Acute systemic anaphylaxis in the horse. Br. J. Pharmacol. 48 (3), 426-437 (1973).
- Wagner, B. IgE in horses: occurrence in health and disease. Vet ImmunolImmunopathol. 132 (1), 21-23 (2009).
- Hellberg, W., et al. Equine insect bite hypersensitivity: immunoblot analysis of IgE and IgG subclass responses to Culicoidesnubeculosus salivary gland extract. Vet. Immunol. Immunopathol. 113 (1-2), 99-112 (2006).
- Schaffartzik, A., et al. Equine insect bite hypersensitivity: what do we know. Vet ImmunolImmunopathol. 147 (3-4), 113-126 (2012).
- Künzle, F., et al. IgE-bearing cells in bronchoalveolar lavage fluid and allergen-specific IgE levels in sera from RAO-affected horses. J Vet Med A PhysiolPatholClin Med. 54 (1), 40-47 (2007).
- Tahon, L., et al. In vitro allergy tests compared to intradermal testing in horses with recurrent airway obstruction. Vet ImmunolImmunopathol. (1-2), 85-93 (2009).
- Wagner, B., Radbruch, A., Rohwer, J., Leibold, W. Monoclonal anti-equine IgE antibodies with specificity for different epitopes on the immunoglobulin heavy chain of native IgE. Vet ImmunolImmunopathol. 92 (1-2), 45-60 (2003).
- Wilson, A. D., Harwood, L., Torsteinsdottir, S., Marti, E. Production of monoclonal antibodies specific for native equine IgE and their application to monitor total serum IgE responses in Icelandic and non-Icelandic horses with insect bite dermal hypersensitivity. Vet ImmunolImmunopathol. 112 (3-4), 156-170 (2006).
- McAleese, S. M., et al. Cloning and expression of the extra-cellular part of the alpha chain of the equine high-affinity IgE receptor and its use in the detection of IgE. Vet ImmunolImmunopathol. 110 (1-2), 187-191 (2006).
- Ledin, A., et al. Generation of therapeutic antibody responses against IgE in dogs, an animal species with exceptionally high plasma IgE levels. Vaccine. 24 (1), 66-74 (2006).
- Siraganian, R. P., Hook, W. A. Histamine release and assay methods for the study of human allergy. Manual of Clinical Immunology. , (1980).
- Neuberger, M. S., et al. A hapten-specific chimaericIgE antibody with human physiological effector function. Nature. 314 (6008), 268-270 (1985).
- Bingham, B. R., Monk, P. N., Helm, B. A. Defective Protein Phosphorylation and Ca2+ Mobilization in a low secreting variant of the rat basophilic leukemia cell line. The Journal of Biological Chemistry. 269 (30), 19300-19306 (1994).
- McAleese, S. M., Halliwell, R. E., Miller, H. R. Cloning and sequencing of the horse and sheep high-affinity IgE receptor alpha chain cDNA. Immunogenetics. 1 (51), 878-881 (2000).
- Hongtu, Y. Study of the structure/function relationship in canine and human IgE as the basis for the development of rational therapeutic intervention strategies in allergic disease. , (2010).
- Sabban, S., et al. Towards a pan-anti-allergy vaccine. JIBTVA. 2 (2), 15-27 (2013).
- Moran, G., Burgos, R., Araya, O., Folch, H. In vitro bioassay to detect reaginic antibodies from the serum of horses affected with recurrent airway obstruction. Vet Res Commun. 34, 91-99 (2010).
