開発<em> in vitroで</emとの相互作用を研究するための>モデル系<em>エクウス</em><em> caballus</emその高親和性受容体FcεRIとした>のIgE
Summary
The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine FcεRIα gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.
Abstract
The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (FcεRI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and FcεRI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine FcεRIα was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine α-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat β- and γ-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine FcεRIα transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using β-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% ± 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.
Introduction
アレルギーは、数千年前から知られている。喘息治療はエーベルス·パピルス（〜1550 BCE）として知られている古代エジプトの医学のテキストで説明して7を治療するための薬草療法を検討した。
今日アレルギーはTヘルパー細胞2型（TH 2）免疫系のアームはアレルゲンと呼ばれる、環境抗原に応答して、免疫グロブリンE（IgE）抗体の産生を操縦するI型過敏性反応、に分類される。 IgEの合成を高めるタバコの煙やディーゼル排気微粒子中の粒子がそうであるように、これらは9、インターロイキン-4およびインターロイキン13 8を含む一般的に免疫系の細胞と相互作用し、炎症誘発性サイトカインの合成および分泌を刺激する多様な物質である10。
過去50年間で先進国におけるアレルギー症状の上昇はの効果の組み合わせに起因している「衛生仮説」11によって提案されたように、TH 2サイトカインによって支配プロファイルに対する免疫応答をシフトするために組み合わせる環境汚染物質、より衛生的な環境へのトレンド、。
上述したように、人間がアレルギーに悩まさ唯一の哺乳類ではありません。注目すべき馬と犬はまた、古典的なアレルギー反応を開発することができますし、12の調査によると、人間のように、馬アレルギーは遺伝的要因と環境的要因に起因する、ことを示している。結果として、これらの動物は、一度臨床症状がで設定したアレルギーの遺伝的および環境的な原因、病気への感作からの進行、および可能な介入戦略との間の相互作用を研究するための優れたモデルを提示
1887年に、Stömmerは、馬の心血管系に対するヒスタミンの効果がある、人間と馬の喘息13の間の類似性を記述した最初の人だった人間14のものと非常に類似している。馬はまた、年間15米1150億ドルの賭け売上高は720億ドル、米国の価値がある競馬産業の礎である。
ほとんどの現代的な競走馬以降1878からレディアン·ブラントによって繁殖アラビア馬の数が少ないの子孫である。現代の競走馬は、一般的にパフォーマンス能力を選択するために近交系されている。彼らは、アレルギー反応をマウントするそれらの感受性であるそのうちの一つ、遺伝性疾患になりやすいです。彼らはまたも、最も深刻なアレルギー人間16よりも1000倍高い血清IgEレベルを持っている。馬アレルギー反応は、通常、虫刺され過敏症（IBH）17、18として明示されている。IBH結果は皮膚炎に起因刺されに属ヌカカで昆虫を形成する。ウマのアレルギー性疾患の別の形態は、これは肺と気道で明らかにされて、再発性気道閉塞（RAO）である。それは、喘鳴やラボによって特徴づけられるOR演算呼吸。 RAOは、一般的に胞子を成形することに応答して発生し、別の調査がこの20を確認していないが、高アレルゲン特異的IgEレベルは、一つの研究19にRAOに罹患している馬に記録された。
ウマアレルギーに関する研究の試みモニタリングにおける、および抗ウマのIgEモノクローナル抗体（mAb）21,22を開発することによって、馬のIgEを中和することを中心に展開し、さらに23による研究では、馬の高親和性Fc受容体のαの細胞外ドメインの生産を議論ウマ血清IgEを検出し、定量する試みで、チェーン（FcεRIα）受容体。 Ledin 24による関連研究では、自己/非自己免疫原を使用して免疫系をプライミングすることにより、血清IgEを中和することを目的とした新しいアプローチについて説明します。すべてのこれらの研究は、しかし、それらのプロトコルの安全性と有効性を試験するための効果的なアッセイを欠いていた。この記事では、我々は今そのようなアッセイsysを提示βヘキソサミニダーゼ放出馬システム、関連する診断および治療戦略の研究に適用可能なTEMは、細胞メディエーターの脱顆粒の指標として、ウマFcεRIαを表現するRBL-2H3.1細胞で評価した。このプロトコルは、異なる種由来のIgEに対する高親和性受容体のIgE結合ドメインをコードする遺伝子でトランスフェクトしたRBL細胞の工学を記述する先の刊行物25、4、5、2、3に基づいている。プロトコルは、結果は、三連の実験の平均値±標準偏差として提示されているβヘキソサミニダーゼ放出アッセイを実行する方法について説明します。
放出アッセイは、最初Siraganianによって開発され、人間のアレルギーを研究するために25をフックした。博士ルーベンSiraganian率いる研究室グループは、RBL細胞株を開発した。これらのRBL細胞は、ヒトFcεRIαを表現するために開発され、プロトコルが4によって出版された。最後のピースアッセイのハプテン4-ヒドロキシ-3-を標的IgEの可変領域をマウス遺伝子の下流に、その重鎖遺伝子をクローニングすることにより、IgE抗体の産生を記載しノイバーガー26の論文でのpSVプラスミドの開発に付属 – ニトロフェナセチル（NP）、得られたキメラ抗体は、完全に機能した。また、RBL細胞の表面上のその受容体をクローニングしながら、同じハプテンを対象とした全てのIgEを開発する能力は、好塩基球細胞の脱顆粒を測定するための有用なプロトコル作るアッセイの標準化をもたらした。
アッセイは、長所と短所を持っています。このアッセイの利点は、任意の哺乳動物系で使用される適応性である、我々の研究室は、ヒト、イヌおよびウマのシステムにおいて脱顆粒をテストするためにそれをこのように使用されており、これは、生物のIgEの合成およびその受容体をクローニングすることによって、単純に達成可能であるRBL細胞の表面上に。
一方、アッセイの短所は、RBL細胞は、それらを同じアッセイ内の脱顆粒のレベルの変化を与えること、熱的、機械とPH変化に非常に敏感であるということです。それは、このように強くアッセイは常に三重に繰り返された後、平均がそれらから取られることをお勧めします。また、RBL細胞は、彼らのメンテナンスが煩雑になっ、延長時間（> 10週間）27組織培養で残っている場合、非放出表現型へシフトする傾向がある。彼らはまた、光学顕微鏡からは見えませんし、細胞の形態を変化させないマイコプラズマ細菌による感染症になりやすいですが、劇的に彼らの脱顆粒レベルを変更します。このように定期的なマイコプラズマ試験が必要とされている。
Protocol
Representative Results
Discussion
要約すると、この調査の結果は、馬FcεRIαを表現するRBL-2H3.1細胞は馬のIgEで感作し、抗原によって挑戦されたとき、彼らは内部のメディエーターの合計量の4.88パーセント±36.68パーセントのピークメディエーター放出を与えることを示した馬FcεRIαを発現していないRBL-2H3.1親細胞に比べて細胞、。
したがって、このアッセイは、in vitroでの馬のアレルギー反応を調査…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Lynda Partridge for the provision of advice and laboratory facilities.
Materials
| RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα | – | – | Produced in the lab |
| Equine IgE anti NIP-HSA | – | – | Produced in the lab |
| 96 Well Plate | Sigma | CLS3595 | – |
| Multi Channel Pipette | Anachem | – | – |
| Incubator | Galaxy R | – | – |
| 4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid | Cambridge Research Biochemicals | N-1070-1 | NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab |
| Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin | Sigma | A6661 | Abbreviated DNP-HSA |
| Plate Spectrophotometer | Anthos Labtec HT2 | – | – |
| Pipes | Sigma | P1851 | – |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | – |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | – |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | – |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | – |
| Triton x100 | Sigma | X100 | – |
| 4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | N9376 | Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | – |
| Citric Acid | Sigma | 251275 | – |
| Sodium Acetate | Sigma | S7670 | – |
| Tris | Sigma | T5941 | – |
References
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