Utvikling av en<em> In vitro</em> Modellsystem for å studere samspillet mellom<em> Equus</em><em> Caballus</em> IgE med sin high-affinitetsreseptor FceRI

Summary

The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine FcεRIα gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.

Abstract

The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (FcεRI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and FcεRI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine FcεRIα was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine α-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat β- and γ-chains ¹. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine FcεRIα transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using β-hexosaminidase release as a readout ^{2, 3}. Mediator release peaked at 36.68% ± 4.88% at 100 ng ml^-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses ^{4, 5}. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease ^{6, 2, 3}.

Introduction

Allergi har vært kjent i årtusener. En astma behandling ble beskrevet i den gamle egyptiske lege tekst kjent som Ebers Papyrus (~ 1550 f.Kr.) og diskutert urte rettsmidler for å behandle den ^7.

I dag allergi er klassifisert som en type I hypersensitivitetsrespons, hvor T-hjelpercelle-type 2 (TH ₂₎ arm av immunsystemet styrer produksjon av immunoglobulin E (IgE) antistoffer i respons til antigener fra miljøet som kalles allergener. Disse er forskjellige stoffer som vanligvis reagerer med celler i immunsystemet og stimulerer syntesen og utskillelsen av pro-inflammatoriske cytokiner, inkludert interleukin-4 og interleukin-13 ^{8, 9} som har partikler i sigarettrøk eller dieseleksospartikler som øker IgE-syntese ^10.

Økningen i allergiske manifestasjoner i industrialiserte land de siste 50 årene har blitt tilskrevet en kombinasjon av effekten avmiljøgifter og en trend til en mer pyntet miljø, som kombinerer å skifte immunresponsen mot en profil dominerte av TH ₂ cytokiner, som foreslått av 'Hygiene Hypotese' ^11.

Som nevnt ovenfor, mennesker er ikke de eneste pattedyr rammet av allergi. Spesielt hester og hunder kan også utvikle klassiske allergiske reaksjoner og en studie av ¹² har vist at, som i mennesker, har hest allergi tilskrives genetiske og miljømessige faktorer. Som en konsekvens, presentere disse dyrene gode modeller for å studere samspillet mellom genetiske og miljømessige årsaker til allergi, dens progresjon fra allergi til sykdommen, og mulige intervensjonsstrategier gang kliniske manifestasjoner har satt i

I 1887, Stömmer var den første personen til å beskrive likheten mellom menneske og hest astma ^13, er effekten av histamin på hest kardiovaskulære systemetmeget lik den hos mennesker ^14. Hester er også hjørnesteinen i hesteveddeløp industrien, som er verdt US $ 72 milliarder kroner med betting omsetning på US $ 115 milliarder årlig ^15.

De fleste moderne veddeløpshester er etterkommere av det lave antallet arabiske hester oppdrettet av Lady Anne Blunt fra 1878 og utover. Moderne veddeløpshester blir ofte innavlet å velge for yteevne. De er utsatt for genetiske forstyrrelser, hvorav den ene er deres følsomhet overfor montere allergiske responser. De har også 1000 ganger høyere serum IgE nivåer enn selv de mest alvorlig allergisk mennesker ^16. Horse allergiske reaksjoner er vanligvis manifestert som insektbitt overfølsomhet (IBH) ^{17, 18.} IBH resultater i dermatitt på grunn av biter danne insekter i slekten Culicoides. En annen form for heste allergisk sykdom er tilbakevendende luftveis hindringer (RAO), dette er manifestert i lungene og luftveiene. Det er preget av tungpustethet og labELLER-behandlet puste. RAO ofte oppstår i respons til muggsporer, og høye allergen-spesifikke IgE nivåer er registrert i hester som lider av RAO i en studie ¹⁹ selv om en annen etterforskning ikke har bekreftet denne ^20.

Studier på equine allergi dreid forsøk på å overvåke og å nøytralisere equine IgE ved å utvikle anti-equine IgE-monoklonale antistoffer (mAbs) ^{21, 22.} Videre studien med ²³ diskuterer fremstillingen av de ekstracellulære domener av equine høy affinitet Fc-reseptor s α kjede (FcεRIα) reseptoren i et forsøk på å påvise og kvantifisere equine serum-IgE. En beslektet studie av Ledin ²⁴ drøfter en ny tilnærming som tar sikte på å nøytralisere serum IgE ved priming immunsystemet ved hjelp av en selv / non-self immunogen. Alle disse studiene har imidlertid manglet en effektiv analyse for å teste sikkerheten og effekten av sine protokoller. I denne artikkelen har vi nå presentere en slik analyse system som gjelder for studiet av diagnostiske og terapeutiske strategier som er relevante for hestens system, der β-heksosaminidase utgivelsen, som en indikator på celle megler degranulation, ble vurdert på RBL-2H3.1 celler som uttrykker hest FcεRIα. Denne protokollen er basert på tidligere publikasjoner ^{25, 4, 5, 2, 3} beskriver konstruksjon av RBL-celler transfektert med genet som koder for det IgE-bindende domene av det høyaffinitets-reseptor for IgE fra forskjellige arter. Protokollen forklarer hvordan man skal utføre en β heksosaminidase-frigivelse assay, hvor resultatene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik av triplikat-eksperimenter.

Utgivelsen analysen ble først utviklet av Siraganian og Hook ²⁵ for å studere menneskelig allergi. Laboratoriet gruppe ledet av Dr. Reuben Siraganian også utviklet RBL cellelinje. Disse RBL celler ble utviklet for å uttrykke menneskelige FcεRIα og protokollen ble publisert av ^fire. Den siste brikkenav analysen kom med utviklingen av plasmidet pSV i papiret ved Neuberger ²⁶ som beskrives fremstilling av et IgE-antistoffer ved kloning av dens tungkjede-genet nedstrøms for en mus gen for en IgE variabelt område som er rettet mot hapten-4-hydroksy-3- -nitro-phenacetyl (NP), det resulterende chimeriske antistoff var fullstendig funksjonell. Evnen til å utvikle en hvilken som helst IgE rettet mot samme hapten, samtidig kloning dens reseptor på overflaten av RBL-celler resulterte i standardiseringen av analysen gjør det et nyttig protokoll for å måle degranulering av basofile celler.

Analysen har fordeler og ulemper. Profesjonelle av analysen er dens tilpasningsevne til å bli brukt i en hvilken som helst pattedyr-system, vårt laboratorium har således benyttes den til å teste for degranulering i de humane, canine og equine systemer, og dette kan oppnås ganske enkelt ved å syntetisere organismens IgE og kloning dets reseptor på overflaten av RBL-celler.

På den annen side,cons av analysen er at RBL celler er svært følsomme for termiske, mekaniske og pH-endringer, noe som gjør dem gir en variasjon av degranulering nivåer innenfor det samme assay. Det er derfor sterkt anbefalt at analysene er alltid gjentas i tre paralleller, og deretter en gjennomsnittlig blir tatt fra dem. Videre RBL celler har en tendens til å skifte mot en ikke-frigjørende fenotype hvis de blir stående i vevskultur for en utvidet ganger (> 10 uker) ^27, noe som gjør deres vedlikehold tungvint. De er også utsatt for infeksjoner av mycoplasma bakterier, som ikke er synlig fra et lysmikroskop, og ikke endrer cellenes morfologi, men ville drastisk endrer sine degranulering nivåer. Således jevn mycoplasma tester er nødvendig.

Protocol

1) Fremstilling av Cell Line: Utvikling av RBL-2H3.1 cellelinje som uttrykker equine FceRI α: Bruke grunnleggende vevskulturteknikker for monolayer cellelinjer, transfektere foreldre RBL-2H3.1 celler ved hjelp av pEE6 plasmid, bærer hest FcεRIα genet (GenBank: Y18204.1) 28. Tilsett 2 ug -1 ul av plasmid DNA til 0,8 ml av celler ved en tetthet på 1,2 x 10 7 celler ml -1. Electroporate cellene ved 250 V 960 uF ved anvendelse av en 0,4 cm electro…

Representative Results

Foreldre RBL-2H3.1 celler og de transfektert med hest FcεRIα reseptor genet ble først sensibilisert med musen IgE anti DNP-HSA og utfordret med DNP-HSA antigen. Mus IgE bindes til den endogene reseptoren i rotte begge cellelinjer og således virker som en kontroll for å teste levedyktigheten til frigjøring begge cellelinjer for å frigjøre mediatorer (figur 1 A). Dette er en viktig sjekk og bør utføres rutinemessig ved siden forlenget (> 10 uker) passasje i cellekultur, RBL-celler 2H3.1 drive…

Discussion

Oppsummert resultatene av denne undersøkelsen viste at når RBL-2H3.1 celler som uttrykker equine FcεRIα er sensibilisert med hest IgE og utfordret av et antigen, gir de en topp megler utgivelsen av 36,68% ± 4,88% av den totale mengden av megler inne i celler, sammenlignet med RBL-2H3.1 foreldre celler ikke uttrykker hest FcεRIα.

Derfor er denne analysen gir et nyttig verktøy for å undersøke og studere hestens allergiske reaksjoner in vitro. Dens tillater bestemmelse av men…

Materials

RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα	–	–	Produced in the lab
Equine IgE anti NIP-HSA	–	–	Produced in the lab
96 Well Plate	Sigma	CLS3595	–
Multi Channel Pipette	Anachem	–	–
Incubator	Galaxy R	–	–
4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid	Cambridge Research Biochemicals	N-1070-1	NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab
Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin	Sigma	A6661	Abbreviated DNP-HSA
Plate Spectrophotometer	Anthos Labtec HT2	–	–
Pipes	Sigma	P1851	–
Sodium Chloride	Sigma	S7653	–
Potassium Chloride	Sigma	P9333	–
Magnesium Chloride	Sigma	M2670	–
Calcium Chloride	Sigma	C1016	–
Triton x100	Sigma	X100	–
4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide	Sigma	N9376	Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO
Dimethyl Sulfoxide	Sigma	D2650	–
Citric Acid	Sigma	251275	–
Sodium Acetate	Sigma	S7670	–
Tris	Sigma	T5941	–