Utveckling av ett<em> In vitro</em> Modellsystem för att studera interaktionen mellan<em> Equus</em><em> Caballus</em> IgE med sin högaffinitetsreceptor FcsRI
Summary
The current study describes the development and applications of a genetically engineered assay system based on the transfection of rat basophilic leukemia cells with the equine FcεRIα gene. Transfected cells express a functional receptor where the release of mediators of the allergic response can be activated by IgE and antigen.
Abstract
The interaction of IgE with its high-affinity Fc receptor (FcεRI) followed by an antigenic challenge is the principal pathway in IgE mediated allergic reactions. As a consequence of the high affinity binding between IgE and FcεRI, along with the continuous production of IgE by B cells, allergies usually persist throughout life, with currently no permanent cure available. Horses, especially race horses, which are commonly inbred, are a species of mammals that are very prone to the development of hypersensitivity responses, which can seriously affect their performance. Physiological responses to allergic sensitization in horses mirror that observed in humans and dogs. In this paper we describe the development of an in situ assay system for the quantitative assessment of the release of mediators of the allergic response pertaining to the equine system. To this end, the gene encoding equine FcεRIα was transfected into and expressed onto the surface of parental Rat Basophil Leukemia (RBL-2H3.1) cells. The gene product of the transfected equine α-chain formed a functional receptor complex with the endogenous rat β- and γ-chains 1. The resultant assay system facilitated an assessment of the quantity of mediator secreted from equine FcεRIα transfected RBL-2H3.1 cells following sensitization with equine IgE and antigenic challenge using β-hexosaminidase release as a readout 2, 3. Mediator release peaked at 36.68% ± 4.88% at 100 ng ml-1 of antigen. This assay was modified from previous assays used to study human and canine allergic responses 4, 5. We have also shown that this type of assay system has multiple applications for the development of diagnostic tools and the safety assessment of potential therapeutic intervention strategies in allergic disease 6, 2, 3.
Introduction
Allergi har varit känt i årtusenden. En astmabehandling beskrevs i forntida egyptiska medicinska text kallas Ebers Papyrus (~ 1550 f.Kr.) och diskuterade naturläkemedel för att behandla det 7.
Idag allergi klassificeras som en typ I överkänslighetssvar, där T-hjälparcell typ 2 (TH 2) armen av immunsystemet styr produktion av immunoglobulin E (IgE) antikroppar som svar på miljömässiga antigener kallas allergener. Dessa är olika ämnen som vanligen interagerar med celler i immunsystemet och stimulerar syntes och utsöndring av proinflammatoriska cytokiner, inklusive interleukin-4 och interleukin-13 8, 9 som gör partiklarna i cigarettrök eller dieselpartiklar som ökar IgE-syntes 10.
Ökningen av allergiska manifestationer i industriländerna under de senaste 50 åren har tillskrivits en kombination av effekterna avmiljögifter och en trend mot en mer sanerad miljö, som kombinerar att skifta immunsvaret mot en profil dominerade med TH 2 cytokiner, som föreslås av "hygienhypotesen" 11.
Som nämnts ovan, människor är inte de enda däggdjur som drabbats av allergi. Särskilt hästar och hundar kan också utveckla klassiska allergiska reaktioner och en studie av 12 har visat att, som hos människa, är hästallergi skrivas genetiska och miljömässiga faktorer. Som en följd av dessa djur presenterar bra modeller för att studera samspelet mellan genetiska och miljömässiga orsaker till allergi, dess progression från sensibilisering till sjukdom, och möjliga interventionsstrategier gång kliniska manifestationer har ställt in
År 1887 Stömmer var den förste att beskriva likheten mellan människa och häst astma 13, är effekten av histamin på häst kardiovaskulära systemetmycket liknar den för människor 14. Hästar är också en hörnsten i hästsporten, som är värt US $ 72 miljarder euro med en vadslagning omsättning på US $ 115 miljarder dollar per år 15.
De flesta moderna tävlingshästar är ättlingar till det lilla antalet arabiska hästar uppfödda av Lady Anne Blunt från 1878 och framåt. Moderna tävlingshästar vanligen inavlad att välja för prestationsförmåga. De är benägna att genetiska störningar, av vilka en är deras känslighet för att montera allergiska svar. De har också 1000 gånger högre serum IgE-nivåer än även de svårast allergiska människor 16. Häst allergiska reaktioner är vanligtvis manifesteras som insektsbett överkänslighet (IBH) 17, 18. IBH ger eksem på grund av bites bildar insekter i släktet Culicoides. En annan form av häst allergisk sjukdom är återkommande luftvägshinder (RAO), detta visar sig i lungor och luftvägar. Det kännetecknas av väsande och labORed andning. RAO uppträder vanligen som svar på mögelsporer, och höga allergenspecifika IgE-nivåer har registrerats hos hästar som lider av RAO i en studie 19 även om en annan utredning inte har bekräftat detta 20.
Studier av hästallergi kretsade kring försök till övervakning och neutralisera häst IgE genom att utveckla anti-häst IgE monoklonala antikroppar (mAbs) 21, 22. Dessutom studien med 23 diskuterar produktionen av de extracellulära domäner av häst med hög affinitet Fc receptorns α kedja (FcsRIa) receptor i ett försök att detektera och kvantifiera häst serum-IgE. En besläktad studie av Ledin 24 diskuterar en ny strategi som syftar till att neutralisera serum-IgE genom att instruera immunsystemet med hjälp av en själv / icke själv immunogen. Alla dessa studier, men saknade en effektiv analys för att testa säkerheten och effektiviteten i sina protokoll. I den här artikeln presenterar vi nu en sådan analys system som tillämpas på studiet av diagnostiska och terapeutiska strategier som är relevanta för häst systemet, där β-hexosaminidas release, som en indikator på cell medlare degranulering, bedömdes på RBL-2H3.1 celler som uttrycker häst FcsRIa. Detta protokoll är baserat på tidigare publikationer 25, 4, 5, 2, 3 som beskriver konstruktion av RBL-celler transfekterade med den gen som kodar för den IgE-bindande domänen av receptor med hög affinitet för IgE från olika arter. Protokollet förklarar hur du utför en β-hexosaminidas frisättningsanalys, vars resultat presenteras som medelvärde ± standardavvikelse för trippelexperimenten.
Analys frisättningen utvecklades först av Siraganian och Hook 25 för att studera människans allergi. Labbet Gruppen leds av Dr Reuben Siraganian utvecklades också RBL cellinje. Dessa RBL-celler har utvecklats för att uttrycka det mänskliga FcsRIa och protokollet publicerades av 4. Den sista pusselbitenav analysen kom med utvecklingen av pSV-plasmiden i papperet genom Neuberger 26 vilken beskrivs framställning av en IgE-antikroppar genom att klona dess tunga kedja-gen nedströms om en gen mus för en IgE-variabel region som riktar haptenen 4-hydroxi-3 -nitro-fenacetyl (NP), var den resulterande chimära antikroppen fullt funktionell. Förmågan att utveckla någon IgE inriktning samma hapten, samtidigt klona dess receptor på ytan av RBL-celler resulterade i att standardisera analysen gör det till ett användbart protokoll för att mäta degranulering av basofila celler.
Analysen har för- och nackdelar. Proffsen av analysen är dess anpassningsförmåga som ska användas i alla däggdjurssystem, vårt labb har således använt den för att testa för degranulering i mänskliga, hund och häst-system, och det är möjligt att helt enkelt genom att syntetisera organismens IgE och kloning sin receptor på ytan av RBL-celler.
Å andra sidan,nackdelarna av analysen är att RBL cellerna är mycket känsliga för värme, mekaniska och pH-förändringar, vilket gör dem ger en variation av degranulering nivåer inom samma analys. Det är därför starkt rekommenderat att analyserna alltid upprepas i tre exemplar och sedan ett genomsnitt tas ifrån dem. Vidare RBL cellerna tenderar att skifta mot en icke-releasing fenotyp om de lämnas i vävnadskultur under en längre tid (> 10 veckor) 27, vilket gör deras underhåll besvärlig. De är också benägna att infektioner av mykoplasmabakterier, som inte syns från ett ljusmikroskop och inte ändrar cellens morfologi, men drastiskt skulle förändra deras degranulering nivåer. Således behövs regelbundna mykoplasmatest.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sammanfattningsvis resultaten från denna undersökning visade att när RBL-2H3.1 celler som uttrycker häst FcsRIa är sensibiliserade med häst IgE och utmanas av ett antigen, de ger en topp mediatorfrisättning på 36,68% ± 4,88% av den totala mängden medlare inuti celler, jämfört med RBL-2H3.1 moderceller som inte uttrycker häst FcsRIa.
Alltså denna analys ger ett användbart verktyg för att undersöka och studera hästdjur allergiska reaktioner in vitro. Dess medger best…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank Dr. Lynda Partridge for the provision of advice and laboratory facilities.
Materials
| RBL-2H3.1 Expressing Equine FcεRIα | – | – | Produced in the lab |
| Equine IgE anti NIP-HSA | – | – | Produced in the lab |
| 96 Well Plate | Sigma | CLS3595 | – |
| Multi Channel Pipette | Anachem | – | – |
| Incubator | Galaxy R | – | – |
| 4Hydroxy-5-iodo-3-nitrophenylacetic acid | Cambridge Research Biochemicals | N-1070-1 | NIP-OH was conjugated with Human Serum Albumin to make NIP-HSA in the lab |
| Dinitrophenyl Conjugated to Human Serum Albumin | Sigma | A6661 | Abbreviated DNP-HSA |
| Plate Spectrophotometer | Anthos Labtec HT2 | – | – |
| Pipes | Sigma | P1851 | – |
| Sodium Chloride | Sigma | S7653 | – |
| Potassium Chloride | Sigma | P9333 | – |
| Magnesium Chloride | Sigma | M2670 | – |
| Calcium Chloride | Sigma | C1016 | – |
| Triton x100 | Sigma | X100 | – |
| 4-nitrophenyl N-acetyl-β-D-glucosaminide | Sigma | N9376 | Stock solution called β-hexosaminidase substrate was 50mM prepared in DMSO |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma | D2650 | – |
| Citric Acid | Sigma | 251275 | – |
| Sodium Acetate | Sigma | S7670 | – |
| Tris | Sigma | T5941 | – |
References
- Taudou, G., et al. Expression of the Alpha Chain of Human FcεRI in Transfected Rat Basophilic Leukemia Cells: Functional Activation after Sensitization with Human Mite-Specific IgE. Int Arch Allergy Immunol. 100 (4), 344-350 (1993).
- Sabban, S. . Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity FcεRI Receptor. , (2011).
- Sabban, S., Ye, H., Helm, B. A. Development of an in Vitro Model System for Studying the Interaction of EquuscaballusIgE with Its High-Affinity Receptor FcεRI. Vet ImmunolImmunopathol. 153 (1-2), 6-10 (2013).
- Wilson, A. P. M., Pullar, C. E., Camp, A. M., Helm, B. A. Human IgE mediates stimulus secretion coupling in rat basophilic leukemia cells transfected with the a chain of the human high-affinity receptor. Eur J Immunol. 23, 240-244 (1993).
- Hunter, M. J., Vratimos, A. P., Housden, J. E. M., Helm, B. A. Generation of canine-human Fc IgE chimeric antibodies for the determination of the canine IgE domain of interaction with FcεRIα. MolImmunol. 45 (8), 2262-2268 (2008).
- Rashid, A., et al. Review: Diagnostic and therapeutic applications of rat basophilic leukemia cells. MolImmunol. 52 (3-4), 224-228 (2012).
- Cohen, S. G. Asthma in antiquity: the Ebers Papyrus. Allergy Proc. 13 (3), 147-154 (1992).
- Dudler, T., et al. A link between catalytic activity, IgE-independent mast cell activation, and allergenicity of bee venom phospholipase A2. J. Immunol. 155, 2605-2613 (1995).
- Machado, D. C., Horton, D., Harrop, R., Peachell, P. T., Helm, B. A. Potential allergens stimulate the release of mediators of the allergic response from cells of mast cell lineage in the absence of sensitization with antigen-specific IgE. Eur J Immunol. 26 (12), 2972-2980 (1996).
- Smyth, L. J., et al. Assessment of the molecular basis of pro-allergenic effects of cigarette smoke. Environ Sci Technol. 34 (7), 1370-1374 (2000).
- Okada, H., Kuhn, C., Feillet, H., Bach, J. F. The ‘hygiene hypothesis’ for autoimmune and allergic diseases: an update. ClinExpImmunol. 160 (1), 1-9 (2010).
- Eder, C., et al. Influence of environmental and genetic factors on allergen-specific immunoglobulin-E levels in sera from Lipizzan horses. Equine Vet J. 33 (7), 714-720 (2001).
- Cook, W. R., Rossdale, P. D. The syndrome of ‘Broken Wind’ in the horse. Proceedings of the Royal Society of Medicine. 56, 972-977 (1963).
- Eyre, P., Lewis, A. J. Acute systemic anaphylaxis in the horse. Br. J. Pharmacol. 48 (3), 426-437 (1973).
- Wagner, B. IgE in horses: occurrence in health and disease. Vet ImmunolImmunopathol. 132 (1), 21-23 (2009).
- Hellberg, W., et al. Equine insect bite hypersensitivity: immunoblot analysis of IgE and IgG subclass responses to Culicoidesnubeculosus salivary gland extract. Vet. Immunol. Immunopathol. 113 (1-2), 99-112 (2006).
- Schaffartzik, A., et al. Equine insect bite hypersensitivity: what do we know. Vet ImmunolImmunopathol. 147 (3-4), 113-126 (2012).
- Künzle, F., et al. IgE-bearing cells in bronchoalveolar lavage fluid and allergen-specific IgE levels in sera from RAO-affected horses. J Vet Med A PhysiolPatholClin Med. 54 (1), 40-47 (2007).
- Tahon, L., et al. In vitro allergy tests compared to intradermal testing in horses with recurrent airway obstruction. Vet ImmunolImmunopathol. (1-2), 85-93 (2009).
- Wagner, B., Radbruch, A., Rohwer, J., Leibold, W. Monoclonal anti-equine IgE antibodies with specificity for different epitopes on the immunoglobulin heavy chain of native IgE. Vet ImmunolImmunopathol. 92 (1-2), 45-60 (2003).
- Wilson, A. D., Harwood, L., Torsteinsdottir, S., Marti, E. Production of monoclonal antibodies specific for native equine IgE and their application to monitor total serum IgE responses in Icelandic and non-Icelandic horses with insect bite dermal hypersensitivity. Vet ImmunolImmunopathol. 112 (3-4), 156-170 (2006).
- McAleese, S. M., et al. Cloning and expression of the extra-cellular part of the alpha chain of the equine high-affinity IgE receptor and its use in the detection of IgE. Vet ImmunolImmunopathol. 110 (1-2), 187-191 (2006).
- Ledin, A., et al. Generation of therapeutic antibody responses against IgE in dogs, an animal species with exceptionally high plasma IgE levels. Vaccine. 24 (1), 66-74 (2006).
- Siraganian, R. P., Hook, W. A. Histamine release and assay methods for the study of human allergy. Manual of Clinical Immunology. , (1980).
- Neuberger, M. S., et al. A hapten-specific chimaericIgE antibody with human physiological effector function. Nature. 314 (6008), 268-270 (1985).
- Bingham, B. R., Monk, P. N., Helm, B. A. Defective Protein Phosphorylation and Ca2+ Mobilization in a low secreting variant of the rat basophilic leukemia cell line. The Journal of Biological Chemistry. 269 (30), 19300-19306 (1994).
- McAleese, S. M., Halliwell, R. E., Miller, H. R. Cloning and sequencing of the horse and sheep high-affinity IgE receptor alpha chain cDNA. Immunogenetics. 1 (51), 878-881 (2000).
- Hongtu, Y. Study of the structure/function relationship in canine and human IgE as the basis for the development of rational therapeutic intervention strategies in allergic disease. , (2010).
- Sabban, S., et al. Towards a pan-anti-allergy vaccine. JIBTVA. 2 (2), 15-27 (2013).
- Moran, G., Burgos, R., Araya, O., Folch, H. In vitro bioassay to detect reaginic antibodies from the serum of horses affected with recurrent airway obstruction. Vet Res Commun. 34, 91-99 (2010).
