Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.
In this demonstration, spheroids formed from the β-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.
Afin de générer un grand nombre de cellules humaines viables et fonctionnelles pour la transplantation, la régulation des conditions de culture est impératif. Épuisement des nutriments, ainsi que l' accumulation de déchets métaboliques sont des contributeurs majeurs à la sénescence et métaboliques changements qui réduisent la qualité du produit de la cellule 1-3. Cette procédure présente un procédé de culture de cellules de mammifère dans sphéroïdes en utilisant un bioréacteur agité associé à un système d'alimentation de perfusion ajustée pour réguler le taux de glucose dans une gamme physiologique 4 pendant toute la durée de la culture. Aux fins de ces études, la gamme physiologique a été définie comme étant comprise entre 100 et 200 mg / dl. Les mêmes procédés peuvent être utilisés pour réguler d'autres éléments nutritifs et de déchets métaboliques tels que le lactate.
cultures statiques dans des petits volumes (1 – 30 ml) sont généralement utilisés dans le cadre du laboratoire de conserver et de différencier les lignées cellulaires pour experimefins NTAL. Cellule repiquage est réalisé avec des changements de milieu complet, au besoin, à intervalles réguliers. La plupart du milieu de culture "classique" a une concentration en glucose élevée (450 mg / dl pour DMEM utilisé dans ces études) pour permettre des changements moyens moins fréquents, sans risque de limitations en nutriments. Cependant, ce procédé par lots alimentation nécessite toujours une manipulation fréquente, présente une variabilité dans l'environnement cellulaire et augmente le risque de contamination de 5 à 9. Bioréacteurs de suspension brassés (SSB) fournissent un meilleur mélange et une diminution de la manipulation 3,10 – 20, mais comme les cultures statiques, nécessitent moyennes modifications manuelles qui contribuent aux fluctuations potentiellement dommageables dans les niveaux de produits nutritifs et des déchets. Perfusion alimentation des cultures SSB réduit ces problèmes en perfusion continue et l'élimination du milieu, mais de grands changements dans les niveaux de nutriments en raison de la croissance des cellules demeurent un problème. L'utilisation d'un ra d'alimentation ajustéete à partir de calculs de l' utilisation des éléments nutritifs en fonction des besoins cellulaires estimés peut fournir l'environnement cellulaire stable nécessaire pour optimiser la viabilité cellulaire et la fonction 21 – 24.
Il y a une abondante littérature décrivant les méthodes de cultures SSB évolutives de cellules de mammifères en particulier pour la culture et l' expansion des cellules pluripotentes 25 – 32, avec d' autres mis l' accent sur l' îlot (beta) cellules 17,33,34, ou la production de produits biologiques 24, 35-38. Beaucoup de ces types cellulaires étudiés peuvent être cultivées dans des cultures sphéroïde, et des procédures spécifiques pour le type de cellule utilisé doit être optimisé avant la mise en œuvre d'un système d'alimentation continue. Dans cette démonstration, un procédé de perfusion d'alimentation a été utilisé pour développer une lignée de cellules bêta cultivées sous forme de sphéroïdes dans un bioréacteur agité 39-43. Le procédé décrit ici fournit unla mise en œuvre directe de l'alimentation des ajustements de taux basés sur des mesures de glucose hors-ligne pour obtenir des conditions de culture ciblées. Réglage de la vitesse d'avance avec cette méthode pour maintenir un niveau de glucose physiologique est montré une augmentation des rendements de cellules. Les cellules de mammifères dépendent d'un nutriment essentiel, le glucose, la production d'énergie, de sorte que l'utilisation de cette lignée cellulaire représente un modèle pour de nombreuses cellules de mammifères cultivées 44. En outre, cette ligne illustre la complexité supplémentaire des cellules bêta, qui sont sensibles aux niveaux de glucose élevés et chroniques 45. Pour cette étude, les cellules ß-TC6 sont autorisés à former des sphéroïdes en culture pour approximer la taille moyenne des îlots de Langerhans in vivo. Le système de bioréacteur à perfusion 17 – 19,21,46 avec un taux d'alimentation adapté à la consommation de glucose, a entraîné le maintien des conditions physiologiques , et les rendements des cellules plus élevées sans modification de la viabilité.
Générer des produits de cellules de mammifères pour la production d'agents biologiques et des thérapies cellulaires nécessite la culture et la surveillance des cellules de mammifères à grande échelle 55-58. En outre, ces applications nécessitent des conditions de culture définies et validées. Il suffit d'augmenter le volume des cellules en utilisant des technologies de recherche ne sera pas répondre à toutes ces exigences. moyennes modifications manuelles causant des…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Michael Garwood and Sam Stein for their helpful comments, and Kristen M. Maynard for assistance with manuscript preparation.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number / Link | Comments/Description |
BTC-6 Cells | ATCC, Manassas, VA | CRL-11506 | Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type) |
DPBS No CA, No Mg | Invitrogen, Carlsbad, CA | 14190-144 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144 |
Dulbecco's Modified Eagles Medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | See below for product numbers | |
DMEM High Glucose (500mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11965-092 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092 |
DMEM Low Glucose (100mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11885-084 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate) |
L-gultamine | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25030081 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product |
Sodium Pyruvate | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11360070 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product |
Heat Inactivated Porcine Serum | Gibco – Life Technologies | 10082147 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147 |
Trypsin-EDTA | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25200056 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product |
T-150 Tissue Culture Treated Flasks | Corning, Corning, NY | 430825 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) &categoryname= |
NuAire Cell culture incubator | Princeton, MN | US Autoflow , Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used | |
Centrifuge | Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used) | ||
Refrigerator | Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies) | ||
1L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-1L | Any vendor could be used http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences) &categoryname= |
2L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-2L | Any vendor could be used |
250 ml stirred bioreactors | Corning, Corning, NY | 4500-250 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences) &categoryname= |
Stir Plate | Fisher Scientific | 11-496-104A | Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor |
Tissue Culture Dishes 100mm Diameter | Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) | 1256598 | Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci) |
FALCON 50 ml Conical Tubes | Falcon, San Jose, CA | 1256598 | Any vendor could be used |
Delran Plastic Used for Custom Parts | McMaster Carr | Various | Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine, http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac |
Stainless Steel Pipe for custom lids | McMaster Carr | Various | Any vendor could be used, http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91 |
Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding | Custom made | Not aware of any vendors producing a similar product | |
Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding | Custom made | Some vendors (eg. Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below | |
Masterflex Digital Peristaltic Pump | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-77919-25 | Any precision peristaltic pump could be used, http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25 |
PVDF Tubing Connectors (various) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | see link | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889 |
Pharmed BPT Tubing L/S 16 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-16 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16 |
Pharmed BPT Tubing L/S 14 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-14 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14 |
Pharmed BPT Tubing L/S 13 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-13 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-13 |
Millipore Millex GP PES membrane 0.22ul sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) | Fisher Scientific | SLGP033RS | Any vendor could be used |
25ml Graduated Pipette | Fisher Scientific | 13-678-11 | Any vendor could be used, and various sizes may be used |
Pipetter | Fisher Scientific | 13-681-15E | Any vendor, or similar product could be used |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | Any vendor, or similar product could be used |
Trypan Blue | Gibco – Life Technologies | 15250-061 | Any vendor, or similar product could be used, https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061 |
Inverted Light Microscope | Leica | Any vendor, or similar product could be used | |
One Touch Ultra Blood Glucose Meter | Fisher Scientific | 22-029-293 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |
One Touch Ultra-Strips | Fisher Scientific | 22-029-292 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |