Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.
In this demonstration, spheroids formed from the β-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.
Для генерирования большого количества жизнеспособных и функциональных клеток человека для трансплантации, регулирование условий культивирования является обязательным условием. Истощение питательных веществ, наряду с накоплением отходов метаболизма являются основными факторами , способствующими стареющих и метаболические изменения , которые снижают качество клеточного продукта 1 – 3. Эта процедура демонстрирует способ к культуре клеток млекопитающих в сфероидов с применением перемешиваемой биореактора в сочетании с отрегулированной системой подачи скорость перфузии , чтобы регулировать уровень глюкозы в физиологическом диапазоне 4 в течение всего периода культивирования. Для целей этих исследований, физиологический диапазон был определен как от 100 до 200 мг / дл. Те же методы могут быть использованы для регулирования других питательных веществ и метаболические отходы, такие как лактат.
Статические культуры в небольших объемах (1 – 30 мл), как правило, используются в лабораторных условиях для поддержания и дифференциации клеточных линий для experimental целей. Cell пассажи выполняется с полными изменениями среды по мере необходимости через регулярные промежутки времени. Большинство "обычных" питательная среда имеет высокую концентрацию глюкозы (450 мг / дл для DMEM, используемого в этих исследованиях), чтобы позволить менее частых изменений средних без риска питательных ограничений. Тем не менее, эта партия вскармливания метод все еще требует частых манипуляций, вносит вариабельность в среде клеток, а также увеличивает риск загрязнения 5 – 9. Перемешанной суспензии биореакторы (SSB) обеспечивают лучшее перемешивание и снижение обработки 3,10 – 20, но как статические культуры, требуют ручного изменения средних , которые способствуют потенциально опасных колебаний в питательных веществах и отходов уровней продукции. Перфузия кормление ОБП культур уменьшает эти проблемы путем непрерывной инфузии и удаления среды, но большие изменения уровней питательных веществ из-за роста клеток остаются проблемой. Использование скорректированной ра подачит.е из расчета питательного использования на основе оценки потребностей клеток может обеспечить стабильную среду для клеток , необходимых для оптимизации жизнеспособности клеток и функции 21 – 24.
Существует большое количество литературы , описания методов для масштабируемых ОБП культур клеток млекопитающих , специально для культуры и расширения плюрипотентных клеток 25 – 32, с другими сосредоточены на островке (бета) клеток 17,33,34, или производство биологических продуктов 24, 35 – 38. Многие из этих исследованных типах клеток, могут быть выращены в культурах сфероидов, и специфические процедуры типа клеток, используемой должна быть оптимизирована до внедрения непрерывной системы подачи. В этой демонстрации, метод перфузии кормления был использован для расширения линии бета – клеток , выращенного в качестве сфероидов в перемешанной биореактора 39 – 43. Описанный в настоящем документе способ обеспечиваетпростая реализация кормления корректировки курса на основе определения уровня глюкозы в офф-лайн для достижения целевых условий культивирования. Регулировка скорости подачи с помощью этого метода для поддержания физиологического уровня глюкозы показано, что урожайность увеличивается клеток. Клетки млекопитающих , зависят от основным питательным веществом, глюкозу, для выработки энергии, так что использование этой линии клеток представляет собой модель для многих культивируемых клетках млекопитающих 44. Кроме того, эта линия иллюстрирует дальнейшую сложность бета – клеток, которые чувствительны к хроническим высоким уровнем глюкозы 45. Для этого исследования, бета-ТС6 клетки оставляли для формирования сфероидов в культуре , чтобы приблизить средний размер островков Лангерганса в естественных условиях. Система биореактора перфузию 17 – 19,21,46 со скоростью подачи , скорректированной на глюкозу потребления, привело к поддержанию физиологических условий , и более высокие урожаи клеток без изменений в жизнеспособности.
Генерирующее клеток млекопитающих для производства биологических агентов и для клеточной терапии требует культуры и мониторинга клеток млекопитающих в больших масштабах 55 – 58. Кроме того, эти приложения требуют определенных и обоснованных условий культивирования. ?…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Michael Garwood and Sam Stein for their helpful comments, and Kristen M. Maynard for assistance with manuscript preparation.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number / Link | Comments/Description |
BTC-6 Cells | ATCC, Manassas, VA | CRL-11506 | Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type) |
DPBS No CA, No Mg | Invitrogen, Carlsbad, CA | 14190-144 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144 |
Dulbecco's Modified Eagles Medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | See below for product numbers | |
DMEM High Glucose (500mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11965-092 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092 |
DMEM Low Glucose (100mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11885-084 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate) |
L-gultamine | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25030081 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product |
Sodium Pyruvate | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11360070 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product |
Heat Inactivated Porcine Serum | Gibco – Life Technologies | 10082147 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147 |
Trypsin-EDTA | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25200056 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product |
T-150 Tissue Culture Treated Flasks | Corning, Corning, NY | 430825 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) &categoryname= |
NuAire Cell culture incubator | Princeton, MN | US Autoflow , Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used | |
Centrifuge | Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used) | ||
Refrigerator | Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies) | ||
1L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-1L | Any vendor could be used http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences) &categoryname= |
2L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-2L | Any vendor could be used |
250 ml stirred bioreactors | Corning, Corning, NY | 4500-250 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences) &categoryname= |
Stir Plate | Fisher Scientific | 11-496-104A | Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor |
Tissue Culture Dishes 100mm Diameter | Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) | 1256598 | Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci) |
FALCON 50 ml Conical Tubes | Falcon, San Jose, CA | 1256598 | Any vendor could be used |
Delran Plastic Used for Custom Parts | McMaster Carr | Various | Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine, http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac |
Stainless Steel Pipe for custom lids | McMaster Carr | Various | Any vendor could be used, http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91 |
Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding | Custom made | Not aware of any vendors producing a similar product | |
Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding | Custom made | Some vendors (eg. Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below | |
Masterflex Digital Peristaltic Pump | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-77919-25 | Any precision peristaltic pump could be used, http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25 |
PVDF Tubing Connectors (various) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | see link | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889 |
Pharmed BPT Tubing L/S 16 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-16 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16 |
Pharmed BPT Tubing L/S 14 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-14 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14 |
Pharmed BPT Tubing L/S 13 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-13 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-13 |
Millipore Millex GP PES membrane 0.22ul sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) | Fisher Scientific | SLGP033RS | Any vendor could be used |
25ml Graduated Pipette | Fisher Scientific | 13-678-11 | Any vendor could be used, and various sizes may be used |
Pipetter | Fisher Scientific | 13-681-15E | Any vendor, or similar product could be used |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | Any vendor, or similar product could be used |
Trypan Blue | Gibco – Life Technologies | 15250-061 | Any vendor, or similar product could be used, https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061 |
Inverted Light Microscope | Leica | Any vendor, or similar product could be used | |
One Touch Ultra Blood Glucose Meter | Fisher Scientific | 22-029-293 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |
One Touch Ultra-Strips | Fisher Scientific | 22-029-292 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |