Nutrient regulation using continuous growth adjusted feeding improves growth rates of mammalian cell spheroids compared to intermittent batch feeding for cultures in stirred suspension bioreactors. This study demonstrates the methods required for establishing simple adjusted rate fed cultures.
In this demonstration, spheroids formed from the β-TC6 insulinoma cell line were cultured as a model of manufacturing a mammalian islet cell product to demonstrate how regulating nutrient levels can improve cell yields. In previous studies, bioreactors facilitated increased culture volumes over static cultures, but no increase in cell yields were observed. Limitations in key nutrients such as glucose, which were consumed between batch feedings, can lead to limitations in cell expansion. Large fluctuations in glucose levels were observed, despite the increase in glucose concentrations in the media. The use of continuous feeding systems eliminated fluctuations in glucose levels, and improved cell growth rates when compared with batch fed static and SSB culture methods. Additional increases in growth rates were observed by adjusting the feed rate based on calculated nutrient consumption, which allowed the maintenance of physiological glucose over three weeks in culture. This method can also be adapted for other cell types.
Al fine di generare un gran numero di cellule umane vitali e funzionali per il trapianto, la regolamentazione delle condizioni di coltura è imperativo. L'esaurimento delle sostanze nutritive, con accumulo di scorie metaboliche sono i principali contributori alla senescenza e metaboliche modifiche che riducono la qualità del prodotto cellulare 1 – 3. Questa procedura illustra un metodo per cellule di mammifero coltura in sferoidi usando un bioreattore agitata combinato con un sistema di alimentazione tasso di perfusione regolata per regolare il glucosio in un intervallo fisiologico 4 per tutta la durata della cultura. Ai fini di questi studi, l'intervallo fisiologico è stato definito come tra 100 e 200 mg / dl. Gli stessi metodi possono essere usati per regolare altri nutrienti e rifiuti metabolici come lattato.
culture statiche in piccoli volumi (1 – 30 ml) sono tipicamente utilizzati in ambiente di laboratorio per mantenere e differenziare le linee cellulari per experimefini ntale. Cellulare passaging viene eseguita con cambi completi medie come necessario ad intervalli regolari. Più terreno di coltura "convenzionale" ha una concentrazione di glucosio alto (450 mg / dl per DMEM utilizzato in questi studi) per consentire meno frequenti cambiamenti medi senza il rischio di limitazioni nutrizionali. Tuttavia, questo metodo batch alimentazione richiede ancora manipolazione frequente, introduce variabilità nell'ambiente cellulare, e aumenta il rischio di contaminazione 5 – 9. Bioreattori sospensione agitata (SSB) fornire una migliore miscelazione e diminuito movimentazione 3,10 – 20, ma, come le culture statiche, richiedono cambiamenti medi manuali che contribuiscono alle fluttuazioni potenzialmente dannosi nei livelli di prodotti nutrienti e rifiuti. Perfusione alimentazione di culture SSB riduce questi problemi infusione continua e la rimozione del mezzo, ma grandi cambiamenti nei livelli di nutrienti a causa della crescita delle cellule rimangono un problema. L'uso di un ra alimentazione adjustedte dai calcoli di uso di sostanze nutritive in base ai requisiti delle cellule stimato in grado di fornire l'ambiente cellulare stabile necessaria per ottimizzare la vitalità delle cellule e funzionare 21 – 24.
Vi è un grande corpo di letteratura che descrive i metodi per scalabili culture SSB di cellule di mammifero in particolare per la cultura e l'espansione delle cellule pluripotenti 25 – 32, con gli altri focalizzata su isolotto (beta), le cellule 17,33,34, o la produzione di prodotti biologici 24, 35 – 38. Molti di questi tipi di cellule indagati può essere coltivata nelle culture sferoidali, e procedure specifiche per il tipo di cella utilizzato dovrebbe essere ottimizzato prima di implementare un sistema di alimentazione continua. In questa dimostrazione, un metodo di alimentazione di perfusione è stato usato per espandere una linea cellulare beta cresciuto come sferoidi in un bioreattore agitato 39 -. 43 Il metodo qui descritto fornisce unsemplice implementazione di alimentazione adeguamenti tariffari sulla base di misure di glucosio off-line per ottenere condizioni di coltura mirati. Regolazione della velocità di avanzamento con questo metodo per mantenere un livello di glucosio fisiologica è indicata ai rendimenti delle cellule aumenta. Le cellule di mammiferi dipendono da un nutriente chiave, glucosio, per la produzione di energia, quindi l'uso di questa linea cellulare rappresenta un modello per molte cellule di mammifero in coltura 44. Inoltre, questa linea esemplifica l'ulteriore complessità delle cellule beta, che sono sensibili ad elevati livelli di glucosio croniche 45. Per questo studio, le cellule beta-TC6 sono stati autorizzati a formare sferoidi nella cultura per approssimare le dimensioni medie delle isole di Langerhans in vivo. Il sistema di bioreattore perfusione 17 – 19,21,46 con una velocità di avanzamento regolata al glucosio consumo, ha determinato il mantenimento di condizioni fisiologiche e rendimenti più elevati cellulari senza cambiamenti di viabilità.
Generazione di prodotti cellulari di mammiferi per la produzione di agenti biologici e terapie cellulari richiede la cultura e monitoraggio di cellule di mammifero in grande scala 55 – 58. Inoltre, queste applicazioni richiedono condizioni di coltura definite e validate. Semplicemente aumentando il volume delle cellule che utilizzano tecnologie di ricerca non si incontreranno tutti questi requisiti. variazioni medie manuali provocando fluttuazioni di sostanze nutritive e l'accumulo d…
The authors have nothing to disclose.
The authors thank Michael Garwood and Sam Stein for their helpful comments, and Kristen M. Maynard for assistance with manuscript preparation.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number / Link | Comments/Description |
BTC-6 Cells | ATCC, Manassas, VA | CRL-11506 | Mouse Insulinoma cell line (adherent cell type) |
DPBS No CA, No Mg | Invitrogen, Carlsbad, CA | 14190-144 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/14190144?ICID=search-14190144 |
Dulbecco's Modified Eagles Medium | Invitrogen, Carlsbad, CA | See below for product numbers | |
DMEM High Glucose (500mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11965-092 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11965092 |
DMEM Low Glucose (100mM) | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11885-084 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11885084 (note that this medium already contains pyruvate) |
L-gultamine | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25030081 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-product |
Sodium Pyruvate | Invitrogen, Carlsbad, CA | 11360070 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11360070?ICID=search-product |
Heat Inactivated Porcine Serum | Gibco – Life Technologies | 10082147 | http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/10082147 |
Trypsin-EDTA | Invitrogen, Carlsbad, CA | 25200056 | https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25200056?ICID=search-product |
T-150 Tissue Culture Treated Flasks | Corning, Corning, NY | 430825 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=430825(Lifesciences) &categoryname= |
NuAire Cell culture incubator | Princeton, MN | US Autoflow , Any water-jacketed CO2 regulating cell culture incubator could be used | |
Centrifuge | Sorvall RT 7 (Any similar benchtop centrifuge may be used) | ||
Refrigerator | Any laboratory refrigerator could be used (a small table-top version was used for these studies) | ||
1L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-1L | Any vendor could be used http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=1395-1L(Lifesciences) &categoryname= |
2L Glass Bottle | Corning, Corning, NY | 1395-2L | Any vendor could be used |
250 ml stirred bioreactors | Corning, Corning, NY | 4500-250 | http://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-US/Shopping/ProductDetails.aspx?productid=4500-250(Lifesciences) &categoryname= |
Stir Plate | Fisher Scientific | 11-496-104A | Any incubator safe stir-plate can be used, any vendor |
Tissue Culture Dishes 100mm Diameter | Nunc, Rochester, NY (Fisher Scientific) | 1256598 | Any vendor could be used (ordered through Fisher Sci) |
FALCON 50 ml Conical Tubes | Falcon, San Jose, CA | 1256598 | Any vendor could be used |
Delran Plastic Used for Custom Parts | McMaster Carr | Various | Any material of choice could be used, but Deran is chosen because it is autoclave safe, non-reactive, and easy to machine, http://www.mcmaster.com/#acetal-homopolymer-sheets/=rjrcac |
Stainless Steel Pipe for custom lids | McMaster Carr | Various | Any vendor could be used, http://www.mcmaster.com/#standard-stainless-steel-tubing/=rjrd91 |
Custom Modified Delran Bioreactor Lids for Continuous Feeding | Custom made | Not aware of any vendors producing a similar product | |
Custom Modified Glass Bottle Lids for Continuous feeding | Custom made | Some vendors (eg. Fischer Sci, Corning) make similar products in the links below | |
Masterflex Digital Peristaltic Pump | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | EW-77919-25 | Any precision peristaltic pump could be used, http://www.coleparmer.com/Product/L_S_Eight_Channel_Four_Roller_ Cartridge_Pump_System_115_230 _VAC/EW-77919-25 |
PVDF Tubing Connectors (various) | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | see link | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Category/Cole_Parmer_PVDF_Premium _Luer_Fittings/55889 |
Pharmed BPT Tubing L/S 16 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-16 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-16 |
Pharmed BPT Tubing L/S 14 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-14 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-14 |
Pharmed BPT Tubing L/S 13 | Cole Parmer, Vernon Hills, IL | WU-06508-13 | Any vendor could be used, http://www.coleparmer.com/Product/Masterflex_PharMed_BPT_Tubing _L_S_13_25/WU-06508-13 |
Millipore Millex GP PES membrane 0.22ul sterile syringe filter (used for venting, and medium filtration) | Fisher Scientific | SLGP033RS | Any vendor could be used |
25ml Graduated Pipette | Fisher Scientific | 13-678-11 | Any vendor could be used, and various sizes may be used |
Pipetter | Fisher Scientific | 13-681-15E | Any vendor, or similar product could be used |
Hemocytometer | Fisher Scientific | 02-671-6 | Any vendor, or similar product could be used |
Trypan Blue | Gibco – Life Technologies | 15250-061 | Any vendor, or similar product could be used, https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15250061 |
Inverted Light Microscope | Leica | Any vendor, or similar product could be used | |
One Touch Ultra Blood Glucose Meter | Fisher Scientific | 22-029-293 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |
One Touch Ultra-Strips | Fisher Scientific | 22-029-292 | Any vendor, or similar product could be used (eg. Bayer) |