Derivazione retina epitelio pigmentato (RPE) da pluripotenti indotte (IPS) Stem Cells dalle diverse dimensioni delle corpi embrionali
Summary
L'obiettivo di questa relazione è quello di descrivere i protocolli per derivare l'epitelio pigmentato retinico (RPE) da staminali pluripotenti indotte (iPS), le cellule con diverse dimensioni di corpi embrionali.
Abstract
Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.
Introduction
Staminali pluripotenti (iPS) cellule indotti sono un tipo di cellule staminali pluripotenti derivate riprogrammando cellule adulte con fattori estrinseci 1. Al contrario, le cellule embrionali staminali (ESC), un altro tipo di cellule staminali pluripotenti, sono generati dalla massa cellulare interna della blastocisti 2-3. Nonostante le loro diverse origini, le cellule iPS e CES sono paragonabili nella loro illimitata capacità di replicare in vitro e nella loro capacità di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula 4-5. Queste caratteristiche di cellule iPS li rendono candidati ideali per applicazioni in medicina rigenerativa personalizzata. I recenti sforzi di ricerca si concentrano sullo sviluppo di protocolli di differenziazione affidabili per la produzione di cellule adulte specializzate, tra epitelio pigmentato retinico (RPE) 6-11.
Per i potenziali applicazioni cliniche delle cellule iPS derivate, una differenziazione diretta di che tipo di cellula specifica indispensabile. Ci sono vari metodipubblicato per la differenziazione diretta di entrambi i CES e iPS cellule in RPE che varia notevolmente nella loro efficienza 6-7, 12-16. Noi ancora non conosciamo molti degli eventi molecolari che governano il destino delle cellule / tessuti durante lo sviluppo o il differenziamento. Negli ultimi anni, sono stati fatti sforzi per sviluppare il protocollo di differenziazione che può imitare lo sviluppo embrionale, per quanto possibile. Durante la fase di blastocisti, la popolazione non impegnati di cellule staminali sono insieme in un microambiente tridimensionale. Così, diverse strategie sono state applicate per rendere le cellule ESC / IPS assemblati insieme e crescere in tre dimensioni. Questi aggregati di cellule staminali sono chiamati corpi embrionali (EBS). Studi hanno dimostrato che EB differenziazione delle cellule staminali imitano fase iniziale di sviluppo dell'embrione e può spontaneamente dar luogo a endoderma primitivo sulla sua superficie esterna. Più tardi, lo sviluppo EB progredisce, fenotipi cellulari differenziate di tutte e tre le linee germinali appaiono 17-18. Therefore, Ebs protocolli di differenziazione basata hanno attirato molta attenzione per la differenziazione in vitro di cellule ESC / IPS e sono un buon candidato per la generazione RPE da cellule staminali pluripotenti 13.
EBs possono essere effettuate utilizzando diversi metodi di cellule / iPS ESC. Inizialmente, EBs sono state fatte da raschiando colonie aderenti e il mantenimento in coltura in sospensione non aderente. Tuttavia, questo approccio produce popolazione eterogenea di EB che provoca scarsa riproducibilità. Hanging coltura cellulare goccia e microwell formazione EBs base sono altre tecniche popolari per la formazione EBs che danno EBs omogenee di dimensioni definite che sono altamente riproducibili. Inoltre, la tecnica micropozzetti può produrre gran numero di aggregati con minor sforzo.
Differenziazione delle cellule all'interno EBS è regolata da un multiplex di spunti morfogenici dal microambiente extracellulare e intracellulare. A differenza di differenziazione in un monFormato olayer, EBs fornire una piattaforma per complesso insieme di cellule e di segnalazione intercellulare a verificarsi 17. È interessante notare, è stato osservato il numero di cellule staminali pluripotenti utilizzati per realizzare singoli EB influenzare il destino di cellule. Ad esempio, in uno studio differenziazione ematopoietica dei CES umani, è stato osservato che 500 cellule EB promosso differenziamento verso linea mieloide che 1.000 celle EB spinto verso lineage eritroide 20. In un altro studio, EBs piccoli favorito differenziazione endoderma mentre EBs grandi promosse verso neuro-ectoderma differenziazione 11, 17.
Questi studi precedenti suggeriscono che il numero di cellule ESC / iPS utilizzati per rendere le singole EB influisce EBS differenziazione in base a qualsiasi tipo di cellule. Tuttavia, a nostra conoscenza, non ci sono studi in corso che hanno chiarito l'impatto di dimensioni EBs nella sua propensione a differenziare verso RPE. L'obiettivo di questo studio è quello di caratterizzare l'influenzaDimensioni EB su indotte pluripotenti staminali (cellule iPS) – retinico pigmentato (iPS-RPE) differenziazione e di individuare il numero di cellulare ottimale per fare EBS per la differenziazione diretta verso RPE lignaggio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per realizzare pienamente le potenzialità delle cellule staminali pluripotenti per terapia cellulare, è necessario regolare la loro differenziazione in modo coerente e riproducibile. Questo rapporto descrive i protocolli per formare EB dimensioni controllato utilizzando la tecnologia micropiastre, avviare differenziazione verso RPE e identificare proteine e geni marcatori di RPE. Per sincronizzare la differenziazione in vitro, misure omogenee di EBs erano formate da un numero noto di cellule iPS centrif…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti- RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | promega | M7502 | |
| High capacity RNA to c DNA kit | Life Technologies | 4387406 | |
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