Derivadas del epitelio pigmentario de la retina (EPR) de madre pluripotentes inducidas (iPS) células de diferentes tamaños de cuerpos embrionarios
Summary
El objetivo de este informe es describir los protocolos para derivar el epitelio pigmentario de la retina (EPR) a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPS) utilizando diferentes tamaños de cuerpos embrionarios.
Abstract
Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.
Introduction
Las células madre pluripotentes inducidas (iPS) son un tipo de células madre pluripotentes obtenidas por la reprogramación de células adultas con factores extrínsecos 1. En contraste, las células madre embrionarias (CES), otro tipo de células madre pluripotentes, se generan a partir de la masa celular interna del blastocisto 2-3. A pesar de sus diferentes orígenes, las células iPS y las CME son comparables en su ilimitada capacidad para replicarse in vitro y en su capacidad de diferenciarse en cualquier tipo de célula 4-5. Estas características de las células iPS les hacen candidatos ideales para aplicaciones en medicina regenerativa personalizada. Los recientes esfuerzos de investigación se centran en el desarrollo de protocolos de diferenciación robustos para la producción de células adultas especializadas incluyendo epitelio pigmentario de la retina (EPR) 6-11.
Para posibles aplicaciones clínicas de las células iPS derivadas, una diferenciación dirigida para ese tipo específico de célula es esencial. Hay varios métodospublicado para la diferenciación dirigida de ambas CES e iPS células RPE en que varía mucho en su eficacia 6-7, 12-16. Todavía no sabemos muchos de los eventos moleculares que gobiernan el destino de las células / tejidos durante el desarrollo o diferenciación. En los últimos años, se han hecho esfuerzos para desarrollar el protocolo de diferenciación que puede imitar el desarrollo embriológico tanto como sea posible. Durante la fase de blastocisto, la población no comprometido de las células madre están juntos en un microambiente tres dimensiones. Así, varias estrategias se aplicaron para hacer las células ESC / iPS reunidos juntos y crecer en tres dimensiones. Estos agregados de células madre se denominan cuerpos embrionarios (EBS). Los estudios han demostrado que la EB diferenciación de células madre imitan etapa temprana del desarrollo del embrión y espontáneamente puede dar lugar a endodermo primitivo en su superficie exterior. Más tarde, como el desarrollo EB progresa, fenotipos de células diferenciadas de los tres linajes germinales aparecen 17-18. Therefore, protocolos de diferenciación basada EBS han atraído mucha atención para la diferenciación in vitro de células ESC / iPS y son un buen candidato para la generación EPR a partir de células madre pluripotentes 13.
EB se pueden hacer usando varios métodos a partir de células / iPS DESC. Inicialmente, los OC fueron hechas por el raspado de las colonias adheridas y mantenerlas en cultivo en suspensión no adherente. Sin embargo, este enfoque produce población heterogénea de EBS que provoca una baja reproducibilidad. Colgando de cultivo celular de caída y la formación de micro pozos EBS basada otras técnicas populares para la formación de EB que producen EBS homogéneos de tamaños definidos que son altamente reproducible. Además, la técnica de micropocillos puede producir gran número de agregados con menos esfuerzo.
La diferenciación de las células dentro de EBS es regulada por un múltiplex de señales morfogénicas del microambiente extracelular e intracelular. En contraste con la diferenciación en una lunformato olayer, EB proporcionar una plataforma para el complejo ensamblaje de las células y la señalización intercelular que ocurra 17. Curiosamente, se observó el número de células madre pluripotentes utilizados para hacer EBS individuales para influir en el destino de las células. Por ejemplo, en un estudio de la diferenciación hematopoyética de los CES humanos, se observó que las células 500 EB promovió la diferenciación hacia el linaje mieloide de las células mientras que 1.000 EB empujado hacia el linaje eritroide 20. En otro estudio, los OC pequeños favorecieron diferenciación endodermo mientras que EB mayores promovidos hacia la diferenciación neuro-ectodermo 11, 17.
Estos estudios anteriores sugieren fuertemente que el número de células ESC / iPS utilizados para hacer EBS individuales afectan EBS diferenciación basado en cualquier tipo de células. Sin embargo, hasta donde sabemos, no hay estudios actuales que han dilucidado el impacto del tamaño de EB en su propensión a diferenciarse hacia RPE. El objetivo de este estudio es caracterizar la influencia deTamaño de EB en las células (iPS) madre pluripotentes inducidas – epitelio pigmentario de la retina (iPS-RPE) diferenciación y para identificar el número de células óptimo para hacer los EBS para la diferenciación dirigida hacia linaje RPE.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para conseguir plenamente las promesas de las células madre pluripotentes para la terapia celular, es necesario regular su diferenciación de una manera consistente y reproducible. Este informe describe los protocolos para formar EBS tamaño controlado utilizando la tecnología de placas de pocillos, iniciar la diferenciación hacia RPE e identificar marcadores de proteínas y genes de RPE. Para sincronizar la diferenciación in vitro, tamaños homogéneos de EB fueron formados por un número conocido de célu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti- RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | promega | M7502 | |
| High capacity RNA to c DNA kit | Life Technologies | 4387406 | |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
- Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
- Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
- Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
