Découlant épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de souches pluripotentes induites (iPS) de différentes tailles de corps embryoïdes
Summary
L'objectif de ce rapport est de décrire les protocoles de dériver l'épithélium pigmentaire rétinien (EPR) à partir de cellules souches pluripotentes induites (iPS) en utilisant différentes tailles de corps embryoïdes.
Abstract
Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.
Introduction
Souches pluripotentes (iPS) induites sont un type de cellules souches pluripotentes dérivées par la reprogrammation des cellules adultes avec des facteurs extrinsèques 1. En revanche, les cellules souches embryonnaires (CSE), un autre type de cellules souches pluripotentes, sont générés à partir de la masse cellulaire interne du blastocyste 3.2. Malgré leurs origines différentes, les cellules iPS et les CES sont comparables dans leur capacité illimitée de reproduire in vitro et dans leur capacité à se différencier en tout type de cellule 4-5. Ces caractéristiques de cellules iPS en font des candidats idéaux pour des applications en médecine régénérative personnalisée. Récents efforts de recherche sont axées sur l'élaboration de protocoles de différenciation robustes pour produire des cellules adultes spécialisées, y compris épithélium pigmentaire rétinien (EPR) 6-11.
Pour les applications cliniques potentielles de cellules iPS dérivées, une différenciation dirigée pour ce type de cellule spécifique est indispensable. Il existe différentes méthodespublié pour la différenciation dirigée des deux cellules iPS en CES et RPE qui varie grandement dans leur efficacité 6-7, 12-16. Nous ne savons pas encore beaucoup d'événements moléculaires qui régissent le sort de cellules / tissus au cours du développement ou de la différenciation. Au cours des dernières années, des efforts ont été faits pour développer le protocole de différenciation qui peut imiter le développement embryonnaire dans la mesure du possible. Pendant la phase de blastocyste, non engagé population de cellules souches sont ensemble dans un micro-environnement en trois dimensions. Ainsi, diverses stratégies ont été appliquées pour rendre les cellules ESC / iPS assemblés et les cultiver en trois dimensions. Ces agrégats de cellules souches sont appelées corps embryoïdes (EBS). Des études ont montré que la différenciation EB de cellules souches imiter stade précoce du développement embryonnaire et peut spontanément donner lieu à endoderme primitif sur sa surface extérieure. Plus tard, le développement EB progresse, les phénotypes de cellules différenciées de tous les trois lignées germinales apparaissent 17-18. Therefore, protocoles de différenciation basée EBS ont attiré beaucoup d'attention à la différenciation in vitro de cellules ESC / iPS et sont un bon candidat pour la production de l'EPR à partir de cellules souches pluripotentes 13.
EB peuvent être faites en utilisant plusieurs méthodes à partir de cellules / iPS ESC. Initialement, EB ont été faites par raclage des colonies adhérentes et les maintenir dans une culture en suspension non adhérent. Cependant, cette approche donne population hétérogène de EB qui entraîne une faible reproductibilité. Hanging culture cellulaire de chute et micropuits formation EB base existe d'autres techniques populaires pour la formation EB qui donnent EB homogènes de tailles définies qui sont hautement reproductible. En outre, la technique de microtitration peut produire un grand nombre d'agrégats avec moins d'effort.
Différenciation des cellules à l'intérieur EB est régulée par un multiplex de signaux morphogéniques de l'microenvironnement extracellulaire et intracellulaire. Contrairement à la différenciation dans un LUN.Format olayer, EBS fournir une plate-forme pour l'assemblage complexe de cellules et de signalisation intercellulaire de se produire 17. Fait intéressant, le nombre de cellules souches pluripotentes utilisés pour fabriquer EB individuels a été observée pour influencer le destin des cellules. Par exemple, dans une étude de la différenciation hématopoïétique des CES humains, il a été observé que 500 cellules EB une différenciation vers la lignée myéloïde des cellules alors que 1000 EB poussé vers lignée érythroïde 20. Dans une autre étude, les petites EB favorisé la différenciation de l'endoderme alors que les grandes EB promus vers la différenciation neuro-ectoderme 11, 17.
Ces études antérieures suggèrent fortement que le nombre de cellules ESC / iPS utilisés pour fabriquer EB individuels affecte les EB différenciation en fonction de tous les types de cellules. Cependant, à notre connaissance, il ne existe pas d'études actuelles qui ont élucidé l'impact de la taille EB dans sa propension à se différencier vers RPE. Le but de cette étude est de caractériser l'influence deEB taille sur souches pluripotentes induites (iPS) – l'épithélium pigmentaire rétinien (iPS-RPE) différenciation et d'identifier le nombre de cellules optimale pour faire EBS pour la différenciation dirigée vers RPE lignée.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour réaliser pleinement les promesses des cellules souches pluripotentes pour la thérapie cellulaire, il est nécessaire de réglementer leur différenciation d'une manière cohérente et reproductible. Ce rapport décrit les protocoles pour former EB grandeur contrôlée en utilisant la technologie de la plaque micropuits, engager la différenciation vers EPR et identifier des marqueurs de protéines et de gènes de RPE. Pour synchroniser la différenciation in vitro, tailles homogènes d'EBS ont é…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti- RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | promega | M7502 | |
| High capacity RNA to c DNA kit | Life Technologies | 4387406 | |
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