المستمدة الشبكية الظهارة الصبغية (RPE) من المستحثة متعددة القدرات الجذعية (آي بي إس) الخلايا عن طريق أحجام مختلفة من الهيئات مضغي
Summary
والهدف من هذا التقرير هو لوصف بروتوكولات لاستخلاص الظهارة الشبكية الصباغ (RPE) من الجذعية المحفزة (آي بي إس) الخلايا باستخدام أحجام مختلفة من الهيئات مضغي الشكل.
Abstract
Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.
Introduction
الجذعية المحفزة (آي بي إس) الخلايا التي يسببها هي نوع من الخلايا الجذعية المحفزة المشتقة عن طريق إعادة برمجة خلايا بالغة مع العوامل الخارجية 1. في المقابل، الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية)، ونوع آخر من الخلايا الجذعية المحفزة، يتم إنشاء من الكتلة الخلوية الداخلية من الكيسة 2-3. وعلى الرغم من أصولها المختلفة، خلايا الجذع والمجالس الاقتصادية والاجتماعية قابلة للمقارنة في قدرة غير محدودة لتكرار في التجارب المختبرية وقدرتها على التمايز إلى أي نوع من الخلايا 4-5. هذه الخصائص من خلايا الجذع جعلها المرشحين مثالية لتطبيقات في شخصية الطب التجديدي. وتتركز الجهود البحثية الأخيرة على تطوير بروتوكولات التمايز قوية لإنتاج خلايا بالغة متخصصة بما في ذلك الظهارة الصبغية الشبكية (RPE) 6-11.
لالتطبيقات السريرية المحتملة للخلايا الجذع المشتقة، والتمايز الموجهة لهذا النوع من خلية معينة أمر ضروري. وهناك طرق مختلفةنشرت للتمايز موجهة من المجالس الاقتصادية والاجتماعية والجذع خلايا كلا في RPE التي تختلف اختلافا كبيرا في كفاءتها 6-7، 12-16. ونحن ما زلنا لا نعرف الكثير من الأحداث الجزيئية التي تتحكم في مصير خلية / الأنسجة أثناء تطوير أو التمايز. في السنوات الأخيرة، بذلت جهود لتطوير بروتوكول التمايز التي يمكن أن تحاكي التطور الجنينى قدر الإمكان. خلال مرحلة الكيسة الأريمية، والسكان غير الملتزم به والخلايا الجذعية هي معا في المكروية ثلاثية الأبعاد. لذلك، طبقت استراتيجيات مختلفة لجعل خلايا ESC / IPS تجميعها معا وتنمو لهم في ثلاثة أبعاد. وتسمى هذه المجاميع الخلايا الجذعية الهيئات مضغي الشكل (EBS). وقد أظهرت الدراسات أن EB تمايز الخلايا الجذعية تحاكي المرحلة المبكرة من تطور الجنين ويمكن أن تعطي بشكل عفوي أدى إلى الأديم الباطن البدائي على سطحه الخارجي. وفي وقت لاحق، كما تقدم EB التنمية، الظواهر خلية متمايزة من كل الأنساب الجرثومية الثلاث تظهر 17-18. عشرerefore، جذبت EBS بروتوكولات التمايز القائم على الكثير من الاهتمام لفي المختبر تمايز الخلايا ESC / الجذع وتكون مرشحا جيدا لتوليد RPE من الخلايا الجذعية المحفزة (13).
EBS يمكن أن يتم باستخدام عدة أساليب من خلايا ESC / IPS. في البداية، أدلى EBS عن طريق كشط قبالة المستعمرات ملتصقة والحفاظ عليها في الثقافة تعليق غير ملتصقة. ومع ذلك، فإن هذا النهج غلة السكان غير متجانسة من EBS الذي يسبب انخفاض التكاثر. شنقا انخفاض زراعة الخلايا وmicrowell تشكيل EBS المعتمدة على تقنيات الشعبية الأخرى لتشكيل EBS التي تسفر EBS متجانسة من الأحجام المحددة التي هي تكرار للغاية. وعلاوة على ذلك، يمكن للتقنية microwell تسفر عن عدد كبير من المجاميع مع أقل جهد.
وينظم تمايز الخلايا داخل EBS من متعدد من العظة morphogenic من المكروية خارج الخلية والخلايا. وعلى النقيض من التمايز في مونشكل olayer، EBS توفير منصة لتجميع معقدة من الخلايا والإشارات بين الخلايا أن تحدث 17. ومن المثير للاهتمام، لوحظ عدد من الخلايا الجذعية المحفزة التي استخدمت لصنع EBS الفردية للتأثير على مصير الخلايا. على سبيل المثال، في دراسة التمايز المكونة للدم من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الإنسان، لوحظ أن 500 خلية EB الترويج التمايز نحو الأنساب النخاعي في حين دفعت 1،000 خلية EB نحو محمر النسب 20. وفي دراسة أخرى، فضلت EBS أصغر الأديم الباطن التمايز في حين EBS أكبر روجت نحو العصبية الأديم الظاهر التمايز 11، 17.
هذه الدراسات السابقة تشير بقوة إلى أن عدد الخلايا ESC / IPS المستخدمة لجعل EBS الفردية تؤثر على EBS التمايز القائم على أي من أنواع الخلايا. ومع ذلك، على حد علمنا، لا توجد دراسات الحالية التي توضيح تأثير حجم EBS في نزوعها إلى التفريق نحو RPE. والهدف من هذه الدراسة هو لتوصيف تأثيرحجم EB على يسببها المحفزة الجذعية (آي بي إس) خلايا – الظهارة الصبغية الشبكية (IPS-RPE) التمايز وتحديد عدد الخلايا الأمثل لجعل EBS للتمايز الموجهة نحو RPE النسب.
Protocol
Representative Results
Discussion
لتحقيق الوعد الكامل للخلايا الجذعية المحفزة لعلاج الخلايا، فمن الضروري لتنظيم التمايز بهم بطريقة متسقة وقابلة للتكرار. ويصف هذا التقرير بروتوكولات لتشكيل EBS التي تسيطر عليها حجم استخدام التكنولوجيا لوحة microwell، والشروع في التمايز نحو RPE وتحديد البروتين والجينات علا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti- RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | promega | M7502 | |
| High capacity RNA to c DNA kit | Life Technologies | 4387406 | |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
- Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
- Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
- Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
