Härrör näthinnans pigmentepitel (RPE) från inducerade pluripotenta stamceller (iPS) Celler med olika storlekar av Embryoid organ
Summary
Syftet med denna rapport är att beskriva de protokoll att härleda näthinnans pigmentepitel (RPE) från inducerade pluripotenta stammen (iPS-celler) med olika storlekar av embryoidkroppar.
Abstract
Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.
Introduction
Inducerade pluripotenta stamceller (iPS-celler) är en typ av pluripotenta stamceller härstammar genom omprogrammering vuxna celler med yttre faktorer 1. I motsats, embryonala stamceller (ESCS), en annan typ av pluripotenta stamceller, genereras från den inre cellmassan av blastocysten 2-3. Trots deras olika ursprung, iPS-celler och ekonomiska och sociala råd är jämförbara i sin obegränsade förmåga att föröka sig in vitro och in deras förmåga att differentiera till någon celltyp 4-5. Dessa egenskaper hos iPS-celler gör dem idealiska kandidater för applikationer i personlig regenerativ medicin. Senaste forskningsinsatser är inriktade på att utveckla robusta differentieringsprotokoll för att producera specialiserade vuxna celler inklusive retinal pigment epitel (RPE) 6-11.
För potentiella kliniska tillämpningar av iPS härledda celler, är väsentligt en riktad differentiering för den specifika celltyp. Det finns olika metoderpublicerat för riktad differentiering av både ekonomiska och sociala råd och iPS-celler i RPE som varierar stort i deras effektivitet 6-7, 12-16. Vi vet fortfarande inte många av de molekylära händelser som styr cellen / vävnaden öde under utveckling eller differentiering. Under de senaste åren har ansträngningar gjorts för att utveckla differentiering protokoll som kan härma embryologiska utveckling så mycket som möjligt. Under blastocysten fasen obekräftat population av stamceller är tillsammans i en tredimensionell mikroomgivning. Så har olika strategier för att göra dem ESC / iPS-celler monterade ihop och odla dem i tre dimensioner. Dessa stamcells aggregat kallas embryoidkroppar (EBS). Studier har visat att EB differentiering av stamceller härma tidigt stadium av embryots utveckling och kan spontant ge upphov till primitiva endoderm på sin utsida. Senare, när EB utveckling fortskrider, differentierade cell fenotyper av alla tre bakterie härstamningar visas 17-18. Therefore, har EBS baserade differentiering protokoll fått mycket uppmärksamhet för in vitro differentiering av ESC / iPS-celler och är en bra kandidat för RPE generering från pluripotenta stamceller 13.
EB kan göras med hjälp av flera metoder från ESC / iPS-celler. Inledningsvis var EB gjordes genom att skrapa bort fastsittande kolonier och behålla dem i icke-vidhäftande suspensionskultur. Dock ger detta tillvägagångssätt heterogen population av EBS som orsakar låg reproducerbarhet. Hängande droppe cellodling och mikro baserade EB bildning är andra populära tekniker för EB formation som ger homogena EB av definierade storlekar som är mycket reproducerbara. Vidare kan mikrotekniken ge stort antal aggregat med mindre ansträngning.
Differentiering av celler inom EBS regleras av en multiplex av morfogena signaler från den extracellulära och intracellulära mikromiljö. I motsats till differentiering i ett monolayer format, EBS ger en plattform för komplex sammansättning av celler och intercellulära signalering ske 17. Intressant nog var antalet av pluripotenta stamceller som används för att göra individuella EB observeras att påverka ödet för cellerna. Till exempel, i en hematopoetisk differentiering studiet av mänskliga ESCs, observerades det att 500-celler EB främjade differentiering mot myeloid härkomst medan 1000-cell EB skjuts mot erytroid härstamning 20. I en annan studie, mindre EB gynnade endoderm differentiering medan större EB främjas mot neuro ektoderm differentiering 11, 17.
Dessa tidigare studier tyder starkt på att antalet ESC / iPS-celler används för att göra individuella EB påverkar EBS baserade differentiering eventuella celltyper. Men till vår kunskap, det finns inga aktuella studier som har klar effekten av EBS storlek i dess benägenhet att skilja mot RPE. Målet med denna studie är att karakterisera påverkan avEB storlek på inducerade pluripotenta stammen (iPS-celler) – retinal pigment epitel (iPS-RPE) differentiering och att identifiera den optimala antalet celler att göra EBS för riktad differentiering mot RPE härstamning.
Protocol
Representative Results
Discussion
För att förverkliga utsikterna av pluripotenta stamceller för cellterapi, är det nödvändigt att reglera deras differentiering på ett konsekvent och reproducerbart sätt. Denna rapport beskriver protokoll för att bilda storleksstyrda EB använder mikrobrunnsplatta teknik startar differentiering mot RPE och identifiera protein och genmarkörer av RPE. För att synkronisera differentiering in vitro, var homogena storlekar av EB bildas av kända antal iPS-celler centrifuge i mikroplattor med tvångs aggrege…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Muñiz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| Y-27632 (Rock Inhibitor) | Stem Cell Technologies | 72304 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030-081 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Aggrewell 400 plate | Stem Cell Technologies | 27940 | |
| AggreWell medium | Stem Cell Technologies | 5893 | |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | |
| BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit | BD Biosciences | 554714 | |
| Mouse Anti-PAX6 antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | ||
| Rabbit Anti- RX antibody | Abcam | Ab23340 | |
| Mouse Anti-MITF antibody | Thermo Scientific | MS-772-P | |
| Rabbit Anti-ZO-1 antibody | Invitrogen | 40-2200 | |
| RNeasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | |
| PCR master mix | promega | M7502 | |
| High capacity RNA to c DNA kit | Life Technologies | 4387406 | |
References
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from fibroblast cultures. Nat Protoc. 2 (12), 3081-3089 (2007).
- Reubinoff, B. E., et al. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (10), 2427-2434 (2009).
- Ukrohne, T. U., et al. Generation of retinal pigment epithelial cells from small molecules and OCT4 reprogrammed human induced pluripotent stem cells. Stem Cells Transl Med. 1 (2), 96-109 (2012).
- Subba, R. M., Sasikala, M., Nageshwar, R. D. Thinking outside the liver: induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19 (22), 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50 (2), 327-332 (2011).
- Mak, S. K., et al. Small molecules greatly improve conversion of human-induced pluripotent stem cells to the neuronal lineage. Stem Cells Int. 2012, 140427 (2012).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Cour la, M., Tezel, T. The Retinal Pigment Epithelium. Advances in Organ Biology. 10, 253-273 (2006).
- Vaajassari, V., et al. Toward the defined and xeno-free differentiation of functional human pluripotent stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Mol Vis. 17, 558-575 (2011).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4 (12), e8152 (2009).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing, and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55 (1), 198-209 (2014).
- Meyer, J. S., et al. Modeling early retinal development with human embryonic and induced pluripotent stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (39), 16698-16703 (2009).
- Bratt-Leal, A. M., Carpenedo, R. L., McDevitt, T. C. Engineering the embryoid body microenvironment to direct embryonic stem cell differentiation. Biotechnol Prog. 25 (1), 43-51 (2009).
- Kurosawa, H. Methods for inducing embryoid body formation: in vitro differentiation system of embryonic stem cells. J Biosci Bioeng. 103 (5), 389-398 (2007).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Ng, E. S., et al. Forced aggregation of defined numbers of human embryonic stem cells into embryoid bodies fosters robust, reproducible hematopoietic differentiation. Blood. 106 (5), 1601-1603 (2005).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (8), 3612-3624 (2006).
