Abstract
突触囊泡融合，通过和检索的动态循环释放神经递质的化学突触。 实时监测突触活动和解剖的不同步骤外-内吞作用的单囊泡水平对于理解在健康和疾病突触功能至关重要。
遗传编码的PH敏感的探针直接靶向突触小泡和全内反射荧光显微镜（TIRFM）提供必要遵循囊泡动力学的时空分辨率。通过全内反射所产生的渐逝场只能激发置于一薄层（<150纳米），其上的细胞粘附在玻璃盖之上的荧光团，正是外 - 内吞作用的过程发生。所得高对比度的图像非常适合囊泡跟踪和融合事件的定量分析。
在这个协议中，SH-SY5Y人N-euroblastoma细胞被提出作为一种有价值的模型为研究，因为他们的平坦面神经递质释放在通过TIRFM单囊泡水平，并分散囊泡的存在。被提供的方法用于生长的SH-SY5Y以贴壁细胞和与突触-pHluorin染它们，以及执行TIRFM和成像技术。最后，战略目标选择，计数和分析，在全细胞和单囊泡融合水平的事件呈现。
为了验证成像过程和数据分析方法，pHluorin标记的囊泡的动力学下休息了分析和刺激（去极化钾浓度）的条件。膜去极化增加的融合事件的频率，并导致记录在全细胞的净荧光信号的并行加注。单囊泡分析揭示聚变事件行为（上升峰的高度和宽度）的修饰。这些数据表明，第在钾去极化不仅诱导大量神经递质释放，而且修改囊泡融合和再循环的机制。
用适当的荧光探针，该技术可以在不同的蜂窝系统可以采用解剖构和刺激分泌的机制。
Introduction
神经元之间的化学突触传递是通信中的神经系统的主要机制。它依赖于神经递质通过囊泡融合和检索的动态循环的释放在突触前部位。许多参与囊泡动力学的蛋白质已被鉴定;然而，它们对这一现象的具体贡献仍有待阐明1。
我们的理解是由以下事实最广泛使用的测定法外/胞吞作用并不总是最合适的部分的限制。相关囊泡融合一些研究和动态依靠电生理技术。这种技术提供了一个最佳的时间分辨率和优良调查囊泡至质膜的初始熔化，但无法检测到许多支持突触功能的基本分子事件。电子显微镜，在另一侧，提供了最好的morphologica每个奇异步骤，但是事件的动态方面的升说明不能被捕获，因为样品必须固定以便进行分析。
的新的光记录技术2,3，结合在荧光分子探针发展4-6进步的出现，使得在活细胞中胞吐过程的可视化，从而提供约突触的结构和功能的信息的新的水平。
最初的研究开发活动相关的苯乙烯染料（FM1 - 43和相关有机染料）7,8。国家的最先进的成像技术采用了绿色荧光蛋白（GFP）（pHluorin）拴管腔小泡蛋白9的pH敏感的变体。这些探针通常被关闭，因为低pH值管腔的囊泡当存在时。融合与质膜后，囊泡内部暴露于中性细胞外空间中，pH突然增加，缓解pHluorin的质子依赖淬火和荧光信号迅速出现。如pHluorin的变化的速度比的融合事件，通过监测荧光的增加，囊泡融合与膜可以测量和分析。因为表面pHluorin标签的分子被内吞，所述荧光信号随后返回到基础水平，因此也可以使用相同的构建体并监控囊泡再循环9。
而囊泡标记的pH传感器可以确保只有那些囊泡真正融合与质膜的可视化，成像在高空间和时间分辨率是必需的，以详细描述了所涉及的外/内吞过程的步骤。的光学技术，它提供了必要的时空分辨率为全内反射荧光显微镜（TIRFM），荧光显微镜10的应用程序。
“>全内反射发生在玻璃盖玻片和样品。当光路到达玻璃盖玻片用的入射角比临界角大的界面，激发光不被传递到样品，但完全反射回去。在这些条件下，一个瞬逝光波的形式在界面处，并传播与较少的光密度（样品）的平台。由于渐逝场的强度呈指数衰减的距离从接口（具有穿透深度约100nm）只在最接近于盖滑移的荧光团可被激发而更远离边界都没有。在转染的细胞用GFP-构建体，该深度对应于表示在质膜上的蛋白质或在囊泡结构接近它。如在细胞内部的荧光团可以不被激励时，所述背景荧光最小化，并具有非常高的信号/背景的大鼠的图像IO形成11。有几个特点使选择的TIRFM技术监测囊泡动态。完美的对比度和高的信号 - 噪声比允许非常低的信号从单个囊泡导出的检测。在各帧的基于芯片的图像采集提供必要检测高动态过程的时间分辨率。最后，细胞的最小曝光的样品中任何其他飞机大大地减少光毒性，并能持久延时录制12。
数据分析仍然这种技术的最具挑战性的和关键的方面。监视囊泡融合的最简单的方法是测量报告荧光蛋白在细胞表面的积累，随着时间的推移13。作为融合的增加，净荧光信号也增加。然而，这种方法可能会低估的过程中，特别是在大的细胞和在静止的条件下，因为内吞作用和漂白过程偏移由于囊泡的胞吐作用的增加的荧光强度。另一种方法是按照每个单个融合事件14。这后一种方法是很敏感的，并且可以揭示关于融合的机制的重要细节。然而，它要求手动选择单一活动，因为完全自动化程序遵循囊泡和登记他们的荧光信号的波动并不总是可用。囊泡动力学的观察要求采样单元在高频率。这会产生大量的数据，可以几乎不进行手动分析。
本文的建议是优化TIRFM成像技术用于监测基底和刺激的神经递质释放，在SH-5YSY神经母细胞瘤细胞系，并描述，一步一步，在实验室中开发的程序来分析数据，既在全细胞和单囊泡水平。
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Protocol
1.细胞培养和转染
- SH-SY5Y细胞培养
注意：使用人神经母细胞瘤SH-SY5Y（ATCC＃CRL-2266）15实验已经完成。 SH-SY5Y细胞成长为浮动集群和贴壁细胞的混合物。按照报告的协议（细胞密度，分光比等 ），以有生长牢固地附着在玻璃盖，其用于TIRFM关键细胞说明书。- 在开始之前，层流生物安全柜下，使无菌磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）和培养基的时机音量。
- 制成50毫升的PBS以150 mM氯化钠，24 mM磷酸盐缓冲液，pH 7.4中的浓度。过滤该溶液。
- 使从Dulbecco改进的Eagle具有高葡萄糖，10％热灭活的小牛血清（FBS），青霉素（100单位/毫升），链霉素（100微克/毫升），L-谷氨酰胺（培养基（DMEM）50 ml的细胞培养基2毫摩尔），和丙酮酸钠（1毫米）。过滤该溶液。
- 除去完全生长培养基，并用3毫升的PBS洗涤细胞。
- 孵育细胞用2ml的0.05％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸（EDTA）（对于6cm培养皿中）中5分钟，在37℃，5％的CO 2，并使用移液管分离的细胞。
- 灭活胰蛋白酶通过加入2ml DMEM中，并通过离心收集细胞，在300×g离心5分钟。
- 除去上清液，加入1 ml DMEM中，以沉淀和吸取的溶液上下充分分散细胞分化成单细胞悬浮液。
- 他们分成1：4在一个新的直径6厘米的Petri装有3毫升完全培养基菜。在一个5％CO 2培养箱保持培养中的细胞在直径6cm的培养皿，在37℃下。子培养，每周一次，或当它们已经覆盖80 - 90％的表面区域。
- 在开始之前，层流生物安全柜下，使无菌磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）和培养基的时机音量。
- SH-SY5Y细胞接种于摄像
- 对于TIRFM实验，板细胞在玻璃盖。采用玻璃覆盖与0.17±0.005毫米的厚度和1.5255±0.00015折射率。开始前，准备盖玻片如下：
- 干净的玻璃覆盖90％的乙醇，O / N。
- 在蒸馏水（蒸馏水三个转变）彻底冲洗。干燥时的玻璃覆盖在干燥炉中。
- 地方覆盖在玻璃培养皿和消毒在预热烘箱中在200℃下进行3小时。
- 在转染前一天，将每个盖玻片在3.5公分培养皿，加入1 ml培养基并在5％CO 2的培养箱中孵育在37℃。
- 如在步骤1.1.3描述Trypsinize细胞 - 1.1.5，暂停将细胞沉淀在1ml完全培养基和计数。计算细胞悬浮液的正确体积添加至每个培养皿中，得到3×10 5细胞/孔。此密度是必需的以获得最佳的细胞生长和有效转染。孵育在37℃下在一个5％CO 2培养箱O / N。
- 对于TIRFM实验，板细胞在玻璃盖。采用玻璃覆盖与0.17±0.005毫米的厚度和1.5255±0.00015折射率。开始前，准备盖玻片如下：
- SH-SY5Ytransfection由聚乙烯亚胺（PEI）
注意：为了形象化突触小泡动力学，已使用含突触-pHluorin pCB6载体。所述突触-pHluorin已在绿色荧光蛋白（GFP）16和小泡膜蛋白突触2.构建体已被广泛用于研究神经元9内突触小泡特性的PH敏感的变体的框内融合生成由。- 在开始转染前，打10毫升以下的解决方案。保持解决方案，最大为1个月。
- 做一个150毫米的NaCl溶液。调节至pH 5.5 0.01N HCl中。
- 使在10％的聚乙烯亚胺（PEI; 25kDa的线性）一个PEI溶液在150mM的NaCl溶液。溶液的pH升高到8.8。调节pH至7.8用0.01N HCl中。
- 铺板后24小时，去除培养基，并用1.5ml的刷新完全培养基。保持所述细胞在37℃，在5％CO 2的培养箱中培养。
- 下的层流生物安全柜，在1.5ml微量离心管中，加入3微克质粒DNA到25微升150 mM氯化钠溶液和100微升每3.5厘米培养皿的PEI溶液。
- 涡旋10秒，然后孵育该DNA / PEI混合物进行30分钟，在RT。
- 小心将DNA / PEI混合物添加到含有盖玻片与细胞培养皿并轻轻摇动，以平均分配，试剂中的培养皿。
- 4小时后，改变培养基，并在5％CO 2的培养箱中孵育细胞O / N在37℃。转染后48小时 - 进行成像试验24。
- 在开始转染前，打10毫升以下的解决方案。保持解决方案，最大为1个月。
通过全内反射荧光显微镜2.细胞成像（TIRFM）
- 成像设置
- 与图1中描述的设置执行的TIRF成像，它包括一个机动倒置显微镜（ 图1，小图a），激光源（ 图1，小图B）和TIRF滑块（ 图1，小图C）。通过高数值孔径（NA 1.45阿尔法普兰-Fluar）100X油，浸泡的目的达到TIRFM照明。
- 对于TIRFM照明，采用多线（458/488/514纳米）100毫瓦氩离子激光。使用单模式光纤，引入线偏振激光光进入光束路径，经由TIRF滑块。插入的TIRF滑块成反射光束路径的发光场光阑平面。
- 对宽视场照明，显微镜连接到常规汞短弧灯HBO白光。在滑块的偏振波保持双棱镜可以确保的TIRF照明和白光的同时的联合。
- 过滤该激光光用激发滤波器（频带宽度十分之四百八十八纳米）安装在滤光轮中，被引入激光路径。聘用高速，软件控制，快门，以便快速控制激光照射。对于pHluorin分析，安装一个带通五十分之五百二十五nm发射过滤器。在快速冷却的CCD摄像头，图像PROPLUS软件捕捉数字影像（512×512像素）。
- 实现的TIRF照明（图2）
- 打开激光，计算机，照相机，滤光轮，并且快门控制器;然后，等待20分钟开始实验的激光器需预热和稳定之前。
- 影像之前，请通过以下方法解决的时机音量。
- 制成50毫升克雷布斯（KRH）溶液在125 mM氯化钠，5mM的氯化钾，1.2mM的MgSO 4干燥，1.2毫KH 2 PO 4，25mM的4-（2-羟乙基）哌嗪-1-乙磺酸（HEPES）（缓冲至pH为7.4），2mM的氯化钙 ，以及6毫米的葡萄糖。
- 使溶于10ml氯化钾-KRH溶液（pH 7.4）中，在80毫米的NaCl，50mM的氯化钾，1.2mM的MgSO 4干燥，1.2毫磷酸二氢钾，25毫米的HEPES（缓冲到pH 7.4），2mM的氯化钙 ，以及6毫米的葡萄糖。
- 与转染细胞中取出玻璃盖，并在适当的成像室插入。装配该室，并在玻璃的中心加入500微升的KRH溶液。
- 加油过的目标。将成像室在显微镜的阶段，并在该玻璃盖玻片定位目标。定位安全盖在样本。
- 在落射荧光模式，专注于盖玻片（上面），然后选择转染细胞放置在室内中心。选择单元格，其荧光信号可以用低于80毫秒的曝光时间可以清楚地记录下来。
- 在软件控制下，切换到TIRF照明在实时模式。
- 要设置的TIRF配置，检查浮现出的目标，在样品上覆盖（ 图2B）的光束的位置。当光束被定位在吨的中心他物镜（ 图2A，左），一个光点是在TIRF样品盖的中心可见（ 图2B，左）和该信元被成像在落射荧光模式（几个聚焦平面，高背景荧光; 图2C，左） 。
- 使用上的TIRF滑块（ 图1C）的角度调整螺钉;达到临界角，将聚焦光点在Y方向（ 图2B中，中心向前或向后）。当光束以一个角度大于临界角大（ 图2A，右）会聚在样品平面，光点消失，一个直的，薄的，聚焦线是显而易见的，在样品盖的中部（ 图2B，右）。
- 要微调的TIRF角度使用细胞样本（ 图2C）。观看的视频的荧光图像，在这个阶段中，落射荧光状图象仍是可见的。轻轻地，将螺丝，直到TIRF CONDITION实现：仅一个光电池的平面是在聚焦（ 即，在与盖滑动接触质膜），这导致在一个平面图像具有高对比度（ 图2C，右）。
- 样品成像
- 设置单声道的时间推移的实验。为了最大限度地减少漂白，使用低曝光时间和高增益捕获图像。适当的曝光时间之间的40 - 80毫秒。在采集的图像1 - 2 Hz的采样频率。囊泡动力学可能是在更高的频率（10赫兹）更好地理解采样。观察常规时间一般为2分钟的。
- 加入500μlKRH解决方案和记录细胞的TIRFM模式。这是静止状态。节省时间序列图像。
- 着眼于静息的相同的条件（激光功率，时间曝光，帧号）根据相同的小区和记录。经过五年的框架，加入500μl的氯化钾，KRH的解决方案，并保持在氯化钾室。这是受激状态;节省时间序列图像。
3.图像分析和数据处理
注意：要分析的图像，宏已经开发了在实验室中，基于该图像分析软件的现有功能;类似宏可在网上（见表材料和设备提供URL）。
- 荧光强度量化
- 使用“序列的荧光强度”宏观为荧光强度定量中的图像的感兴趣区域（ROI）的区域中，在电影的过程。
- 打开时间序列图像。转到宏观菜单，然后选择“序列荧光强度”。在“分析”窗口出现“选择ROI”。
- 选择的选择的工具之一，在菜单中创建的投资回报率。放置3感兴趣区在细胞膜的区域无斑点（背景ROI）。聘请THIs“背景的ROI”来评估漂白和设定的阈值的融合事件的分析（ 图3A）。
- 漂白校正和阈值判定（图3B）
- 评估漂白，打开荧光强度行“背景的投资回报”，（ 图3BA）。正常化在每个帧的初始强度值（F 0）（F / F 0）（ 图3BB）的荧光强度值。平均化的值。
- 突出的平均数据，并使用图表菜单选项的线图。
- 从数据分析菜单中选择“趋势线”，打开图分析对话框。选择回归的类型。设置“指数”的回归。然后选择“在图表上显示方程”。在图形窗口中，指数方程出现的参数值将被自动分配，（ 图3BC
- 指数修正适用于每个帧如下的强度值：
FN（修正）= FN / EXP（N *一）
FN =在帧n实验测量荧光强度; N =帧数;一个=漂白因子（恒定表达强度的损失是由于光漂白速率; 图3BD）。 - 以设定阈值，打开一个规格化和校正“背景的ROI”，计算平均荧光信号，其标准偏差（SD）。平均值加上3 SD代表的阈值（ 图3BE）。使用此阈值进行数据分析。
- 使用半自动程序的融合活动选择
- 打开用图像分析软件的时间序列图像。应用高斯滤波器活动图像序列。
- 使用“计算对象”工具或宏允许选择分析图像的一个对象，其像素具有一个限定的范围内的平均荧光强度。设置强度范围手动，使用阈值函数（去酒吧的菜单，设置测量→门槛，突出感兴趣的区域）。适当的阈值是在本地的荧光背景信号的30％。
- 应用宏“过滤器对象”选择符合以下条件的唯一对象：
- 应用范围选项（最小和最大含）方面。一方面报告长轴和等同的对象的椭圆的短轴之间的比率。看点永远是≥1。适当的值是分= 1，最大值= 3。
- 适用范围的直径。 直径报道在2度间隔连接两个轮廓点并穿过对象的质心测量的直径的平均长度。设置在像素的范围内（或者在微米，如果使用校准系统）。
- 定义prelimin最佳范围元实验：手动选择感兴趣的点，然后使用积曲线函数测量它们的直径。
- 选择“显示对象”：选择的对象会出现叠加到TIRFM图像（ 图4B）。
- 包括在分析中只有那些表现出短（一到三个帧）点的瞬态荧光强度增加，紧接着的信号（瞬时点）的显着损失。采用圆形选择大约一个光斑直径径向创建一个ROI围绕选定的囊泡/点（实验的ROI）。手动执行此步骤。
- 与感兴趣区选择，计算在电影的过程中的每个ROI的平均荧光强度。
- 数据分析（图3C-D）的
- 导出的时间过程中的每一个“实验的ROI”到电子表格测得的荧光变化; （ 图3DA）。正常化在每一帧的初始荧光强度（F / F 0），（ 图3分贝 ）的强度值。
- 所报告的步骤3.2.4（ 图3Dc的 ）中的每个帧的指数应用校正强度值。
- 计算的融合事件的总数（峰数），每个聚变发生的时间（峰宽）和荧光峰（峰高和AUC）的振幅申请使用的电子表格或数学软件包逻辑功能。使用逻辑公式聚变事件分析的一个例子报道于图的3DD和3DE。
- 假设荧光强度超过阈值（平均背景荧光强度±3SD），为小泡的融合到质膜的增加，将所得的峰为融合事件。
- 计算峰宽作为最后的和每个峰的第一x值之间的差异。这个值乘以1 /（采样频率）。考虑这个值š囊泡融合和粘附在质膜囊泡重新酸化和回收（ 图的3DD）之前的时间。
- 计算的全细胞的AUC作为值超过阈值的总和。考虑这个值作为在记录时间由于自发（休息）净荧光改变或诱发（刺激）突触活动。
- 计算峰高为每个峰和阈的最大y值之间的差。考虑这个值作为指示融合型（单与同时/顺序融合或瞬态主场迎战全融合）的。
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Representative Results
描述的全内反射荧光成像和数据分析程序的目的是研究在蜂窝系统囊泡动态。这种技术可以被用于确定信号分子和药物对聚变事件和神经递质的囊泡动力学17的影响。使用GFP标记质膜蛋白，所述TIRFM分析已被用来表征在胶质GFP标记谷氨酸转运和上皮细胞18,19的构贩卖。
为了验证报告的成像过程和数据分析策略，融合事件被记录在基础和刺激条件（钾引起的去极化），在转突触-pHluorin SH-SY5Y神经母细胞瘤。 （ 视频1，2，分别）。两种不同的分析被执行：全细胞（ 图4）和单囊泡分析（ 图5）。
全细胞分析MEA祖雷斯贝尔在细胞融合事件和刺激所诱导所得净荧光变化的总数。在图4中，突触-pHluorin转染的细胞被记录下休息和刺激条件（氯化钾刺激），使用相同的实验方案（时间曝光，激光功率等）。 图4A示出了突触-pHluorin蓄积在荧光泪点散布在细胞膜。如在文献中所描述的，微弱的荧光信号也存在于质膜9;该信号是有用的，以确定细胞进行成像。在图4B中，通过在纸（第3.3节）中描述的自动程序选定点被叠加到报告， 如图4A所示 。 图4C的TIRFM图像显示静止的条件下选择的点的归一化的荧光强度分布。这些配置文件揭示了类似的荧光为int的单个峰的存在密度表示出来，在不同的时间在记录过程中，可能对应于囊泡，偶尔融合与膜。 图4D示出了氯化钾的刺激的效果。正如预期的那样，去极化与25毫米氯化钾引发迅速的反应和几个非常明亮的荧光泪点出现在细胞膜上（ 视频2）。这些泪点对应于本质膜下方突触囊泡的“可释放”池。在个别的斑点对应测量荧光变化的时间过程分析表明峰的存在下，可变荧光强度的，该申请的分泌的刺激（ 图4D和4F）之后出现突然。全细胞分析时记录的时间的结果列在图4E-H。氯化钾的刺激导致的融合事件的数量迅速明显增加（超过静止条件2.5倍的增加）（图4E-F），并且在所得到的荧光强度的变化（超过静止条件9.3倍的增加）（ 图4G-H），从而表明大量神经递质释放。
单峰分析允许单聚变事件（ 图5）的表征。 图5A示出的顺序 具有代表性的“实验性的投资回报率”静息条件下录制的图像。具体强调了突触-pHluorin标记的囊泡它与TIRF区域下的膜融合。两帧后，荧光信号消失，表明可能的囊泡检索和重新酸化。感兴趣的区域的归一化的荧光分布（ 图5B）测量的增加，在点出现在TIRF区对应的荧光信号。相反，荧光斑点消失后返回到基础水平（单峰平均宽度1.91±0.32秒;平均峰高度0.042±0.005标准化荧光强度）。 图5C和5D示出了“实验性的ROI”下的KCl刺激记录的连续图像和相应的归一化的荧光强度分布。注意增加囊泡进出氯化钾去极化后的TIRF区的移动。
40聚变事件被选择和在静息分析和刺激的条件。以下参数测量：平均峰的AUC，峰的宽度和高度。峰宽指定重新酸化和回收， 图5G前囊泡融合，附着和内吞作用的时间。峰高度测量诱导的囊泡融合， 图5F的荧光强度的变化。这些参数的变化均显示出不同的胞吐作用的机制。单峰的分析表明，氯化钾去极化修改囊泡融合到质膜的模式。实际上，增加的平均峰面积（3.8±0.2倍增加了静止的条件下，P <0.01，通过配对t检验， 图5E），峰高（2.75±0.03倍，P <0.01，通过配对t检验， 图5F）和宽度（2.6±0.5倍，P <0.05，通过配对t检验。 图5G）被刺激的条件下进行检测。几种解释，可以设想这些结果。一种可能性是该氯化钾去极化引起的同时和/或顺序融合的囊泡中的细胞的约束区域。另一种解释是，强去极化有利于充分融合与瞬态融合。在基础条件下，主要的机制是一个短暂的融合：一个融合孔的形式，在小泡的增加和出现荧光信号的pH值，但孔立即关闭，从而允许快速再酸化和回收。下刺激的条件下，囊泡完全与质膜，所述峰的高度和宽度的增加作为捕膜囊泡组件，重新酸化和回收，可能需要更长的时间保险丝。类似的结果最近已获得在分析内分泌β细胞突触20类微泡胞吐作用。
图1. TIRF显微镜设置。在TIRF显微镜系统的示意图和图像（插图）。该设置包括将Axio上观察Z1机动倒置显微镜（A）中，多线100毫瓦氩离子激光器（B）和一个TIRF滑块（℃）。激光（绿线）和白光（黄线）被示出。细胞使用的是100×油浸物镜成像。数字图像被捕获在冷却RetigaSRV快速CCD照相机。裁判讲师模块，发射（一十分之四百八十八纳米）和激发（带通五十〇分之五百二十五纳米）过滤器，准直器（L1）和聚焦（L2）镜头表示。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2.获取TIRFM配置（A）的示意图的卡通图示的目的，盖防滑，样品和激光束的位置（蓝线）。 左，激发光束行进直接通过盖滑样品接口。样品被激发作为萤光模式中心 ，激发光束的形式与样品不超过临界角的入射角下，光照射样品以可变的角度。 对 ，激发光束形成INCID耳鼻喉科角度大于临界角时，光完成反射回物镜，和一个渐逝场传播的样本。 （B）中示出卡通样品盖和激发光束（蓝色圆圈）的位置，即浮现出的目标，从落射荧光（ 左 ）朝向的TIRF照明（ 右 ）的过渡过程中。 （C）的落射荧光（ 左）和TIRFM（ 右）的突触-pHluorin荧光在现场的SH-SY5Y细胞的图像。比例尺：10微米请点击此处查看该图的放大版本。
图3.数据处理和分析。（A）的突触-pHluorin荧光现场SH-SY TIRFM图像5Y细胞。绿色的方块表示有代表性的“背景的投资回报率”。比例尺为10μm。 （B）建议的工作流程背景的投资回报率。从上到下：。在后台的ROI测量荧光强度的变化的时间过程; B正常化的荧光变化的初始荧光值（F / F 0）; C应用程序的指数回归;ð校正光漂白， 即门槛评价（透明的灰色方块）。 （C）TIRFM的突触-pHluorin荧光现场SH-SY5Y细胞图像。白色方块表示代表“实验的投资回报率”。比例尺为10μm。 （D）建议的工作流程实验ROI。从上到下：一个的荧光强度变化的时间过程; B数据正常化到初始荧光值（F / F 0），C。 ;去应用逻辑功能检测数峰值，AUC，宽度和高度。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4.全细胞分析（A）TIRFM在现场SH-SY5Y细胞的突触-pHluorin荧光图像。细胞记录下休息和刺激（25毫米氯化钾应用程序）条件（采样1赫兹）。比例尺：10μm以下。 （B）中所确定的自动程序斑点叠加显示（绿色）的TIRFM图像上。 （C）的标准化荧光强度静止的条件下，在整个小区由自动程序选定斑点的轮廓（F / F 0）。 （D）NormalizED荧光强度刺激条件下选择的景点分布（F / F0）。过的痕迹吧指示氯化钾应用。 （EH）的事件，并在休息（蓝色）和刺激的（红色）的条件下记录的，在整个细胞的荧光强度变化的数量。 （E）的直方图示出记录在细胞融合事件的总数。 （F）的融合事件时间分布。 （G）表示在全细胞（共AUC）发生变化pHluorin荧光强度直方图。 （H）曲线展示累计pHluorin荧光强度变化与时间的函数。 请点击此处查看该图的放大版本。
视频2，SH-SY5Y细胞表达突触-pHluorin刺激条件（采样1赫兹）下记录。氯化钾灌注表示。 请点击此处观看该视频。
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Discussion
本文提出了一种协议，以图像和分析囊泡动力学分泌细胞，采用荧光基因编码向量和TIRFM。成功的成像通过TIRFM关键要素是细胞模型和细胞转染与囊泡释放和回收的基因编码的光学指标的选择。
TIRFM非常适合于细胞生长附着于玻璃盖和足够平坦以使膜融合事件的稳定可视化。囊泡最好应分散在细胞使它们的贩卖，融合和胞吞作用可以被成像和量化在单囊泡水平。不幸的是，神经元不符合这些标准：它们具有不规则的形状，突起频繁彼此交叉，并且囊泡融合prevalently集中在小区域（有源区）。对于这些区域是非常困难的神经元的原代培养研究囊泡动力学通过TIRFM。
虽然不同的转染试剂和程序的可用性，使转几乎是标准程序在SH-SY5Y，甚至在原代神经元的文化，必须注意记录时，分析和解释数据TIRFM采取。 TIRFM便于关于该处或附近的膜发生在活细胞中的进程的信息的收集，并且使单个分子事件的分析通过检测从移动或移出日提交的瞬逝标签蛋白衍生的变化的荧光信号的。然而，一些因素可以修改的荧光信号在该区域中，而不一定意味着外/内吞事件，并且这必须采取n为进考虑记录和分析数据时。其中有在细胞形态变化，特别是那些在消逝场和荧光团修饰关于焦点的平面中的记录。
形态变化
高分辨率的TIRF技术依赖于荧光团的渐逝场中的激发，具有100nm从玻璃界面11的深度。这是一个非常薄的区域和不易察觉的修改形态预期改变细胞平面聚焦。这尤其适用于呈现几个过程，并表现出明显的皱裂的神经元和细胞。在这些细胞中，膜面积与记录时的盖玻片接触是不规则的，并且可以迅速地改变，从而导致胞吐作用的不准确的评价。出于这个原因，只要有可能，以选择调查的细胞模型是重要的。为了限制电池movemeNTS可以帮助涂层玻璃盖与细胞外基质蛋白或聚-L-赖氨酸。然而，我们必须记住，这些基板可以改变细胞的行为和囊泡动态。
形态学修饰记录期间的其他可能来源是细胞刺激，另外的解决方案，和温度的变化。刺激能够诱导大量小泡释放（ 即氯化钾去极化）常常引起细胞收缩，显然修改的TIRF区下细胞表面。因此重要的是，选择准确的刺激在初步实验的类型，浓度和施用时间。
简单介绍的解决方案与吸管浴，独立组合物的，可通过剪切应力引起的细胞形态的修改。为了解决这个伪影，添加培养基优选使用灌注系统，用真空泵可能连接以降低噪声。
荧光
的荧光信号的改变也可能在录制过程中是由于荧光团修饰。最重要的是漂白23。漂白是荧光团的光子诱导的分解。它通常会导致荧光观测样本的和调光随时间的永久丢失。在TIRFM，只有荧光团封闭，渐逝场的起源可光漂白和GFP标记的膜蛋白被光漂白，因为它们驻留在这一领域。荧光发射强度的衰落的预防是非常重要的，以获得高质量的图像，而必须采取的定量荧光显微术。具有合理的近似，在一个恒定环境中的给定分子，漂白取决于时间和暴露于激发源的周期。在许多情况下，光漂白如下一个简单的指数衰减函数，这使得通过进行控制的记录23的评估和修正容易。不同的校正公式/宏可在网上（见表材料和设备）;在该协议的简单exponenti人功能已被使用。
有几个策略，以克服漂白。一个好的策略是防止在漂白的来源，例如，使用荧光具有高光。不幸的是，现在，DNA编码的探头的选择仍然有限。在这种情况下，活性的损失所造成的光漂白可成像采集期间被最小化，优化时间范围的光照射时，输入的光的光子能量和采样的频率。
当使用对pH敏感的探针，荧光团修饰的记录期间进一步源是在介质中的pH值变化。录音室的液体体积通常非常低，药物的应用，细胞活性和代谢可能改变介质的pH值，特别是在细胞和盖玻片的表面之间的微小体积。这反过来，改变了pHluorin荧光信号，从而造成过/低估的囊泡重租赁。例如，强刺激可导致细胞溶质的钙依赖性酸化并在细胞外空间镜像碱化，从而导致在所述荧光信号24以夸张的增加。
为了避免这个问题，一定要使用缓冲溶液和监测既定方案出台可能pH值的修改，在初步实验。为诱发囊泡释放的分析数据时更准确的估计，监视无融合事件在细胞表面的一个区域中的荧光信号，并在这个区域内使用的荧光信号的修改调整因子。
总之，用于监测和分析囊泡融合和动力学的方法已经描述。这种技术可以用在不同类型的细胞（神经元和内分泌细胞）来可视化和解剖的各个步骤外/胞吞的，揭示蛋白质及其pathogeni的作用Ç突变体在囊泡动态的监管和揭示的目标构成和调控胞吐药物的作用机制。
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Acknowledgments
笔者想承认UNIVERSITA德利阿布鲁Studi住宅米兰向埃利安娜迪卡伊拉诺（博士后奖学金）和斯特凡莫雷蒂（博士奖学金）的支持。这项工作是由大学研究计划PUR到CP支持
我们要感谢教授杰里米·M.亨利，生物化学学院，布里斯托，英国的大学，为pHluorin建设和Dotti弗朗西斯博士在数据分析的援助，和Silvia Marsicano技术援助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Axio Observer Z1 |  Zeiss |
491912-9850-000 | inverted microscope |
| Multiline Argon Laser Lasos 77 | Lasos |
00000-1312-752 | multi-line (458/488/514 nm), 100 mW argon-ion laser |
| Laser TIRF slider | Zeiss |
423681-9901-000 | |
| 100X Objective | Zeiss |
421190-9900-000 | Oil, NA 1.45 Alpha-Plan |
| CCD Camera RetigaSRV Fast 1394 | QImaging |
||
| LAMBDA 10-3 optical filter changer with SmartShutter | Sutter Instrument Company |
||
| Software | |||
| Image ProPlus 6.3 Software | Media Cybernetics |
spot selection, ROI selection, fluorescence intensity determination | |
| Excel | Microsoft |
photobleaching correction, whole-cell and single-vesicle analyses | |
| GraphPad Prism 4.00 | GraphPad Software, Inc. |
statistical analysis | |
References
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