تقييم شجيري تشجر في التلفيف المسنن من منطقة الحصين في الفئران
Summary
We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.
Abstract
Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.
Introduction
تغييرات ديناميكية في عدد وهيكل من نقاط الاشتباك العصبي هي السمات المميزة للتنمية، والشيخوخة، والعديد من الاضطرابات العصبية 1-3. قدرة الخلايا العصبية لاستقبال ودمج المعلومات متشابك تعتمد على التشكل شجيري والتعديلات الديناميكية في الاتصالات متشابك. في الواقع، وجود علاقة إيجابية بين العمود الفقري شجيري وعدد المشبك، وكلاهما يؤثر الوظيفة الإدراكية 4. وبالتالي، فإنه ليس من المستغرب أن التناقصات في عدد العمود الفقري شجيري ارتبطت الخلل المعرفي في عدد من الاضطرابات العصبية 5-7، مما دفع اهتماما كبيرا في شجيري العمود الفقري الكمي. ومع ذلك، فإن القياس الكمي للكثافة العمود الفقري يبقى تستغرق وقتا طويلا ومهمة شاقة أن فشل لتوليد المعلومات المفيدة عن التضاريس وتوزيع نقاط الاشتباك العصبي في جميع أنحاء شجرة شجيري. لحسن الحظ، وأساليب تلطيخ (على سبيل المثال، جولجي كوكس وdoublecortin (DCX)) بالاشتراكمع تقنيات التصوير المتطورة يمكن استخدامها للتغلب على الحواجز الحالية وإنتاج صور عالية الدقة من تشجر شجيري بطريقة موثوقة وسريعة. في حين جولجي كوكس التلوين بطريقة يمكن نشرها لتقييم حالة تشجر شجيري في جميع الخلايا العصبية 8، DCX يمكن نشرها لتسمية الخلايا العصبية ولدت حديثا وخاصة في منطقة التلفيف المسنن وsubventricular 9، وهو عامل مهم بالنظر إلى أن تكوين الخلايا العصبية يحدث في كل من هذه المناطق في مختلف مراحل العمر 10،11.
وبعد تلطيخ، تم نشر طريقتين التصوير لتقييم الخصائص شجيري: ط) التصوير في الوقت الحقيقي (RTI) والثاني) عمق طويلة من التصوير الميدان (EDFI). وتوفر هذه التقنية RTI وسيلة لتتبع وقياس طول وترتيب تشجر على طول قطاعات وفروع شجيري الفردية. وبالتالي فإنه تمكن واحد لتقدير المساحة الكلية وحجم المحتلة من قبل كل شجرة شجيري. عن الصورةpecifically، في طريقة RTI المستخدم يحدد بشكل مستمر القطاعات ويعيد تركيز تكرارا مثل الخلايا العصبية تتبع البرمجيات بجمع X، Y، Z والإحداثيات للهيكل شجيري ويعيد مسار هيكل شجيري في 3D. نسبيا، ويوفر طريقة EDFI وسيلة بسيطة نوعا ما، والمعجل لتقييم كثافة الجذعية في عينات الأنسجة السميكة وليس عن طريق توليد صورة مركبة، وتوفير المعلومات على كامل المحور Z. للقيام بذلك، ويسجل المستخدم عالية الوضوح ملفات الفيديو في جميع أنحاء سماكة المقطع ثم يستخدم البرنامج للبحث في إطارات الفيديو للتعرف على نقاط حيث بكسل تماما في التركيز. بعد ذلك، يتم دمج بكسل مركزة وإدماج عالية الدقة، صورة 2D المركبة. تحتوي هذه الصورة المركبة كل بكسل التي كانت في التركيز بغض النظر عن وضعهم في المحور z. يمكن استخدام تحليل نوعي وكمي لهذه الصور 2D في وقت لاحق لتحديد الكثافةالمتفرعة من شجيري في كل حقل.
وأخيرا، فإننا نقدم وسيلة بانورامية لتوليد غاية صور عالية الدقة لتحليل وتقييم التشعبات في المنطقة بأسرها من الفائدة. ويمكن نشر هذه التقنية للتغلب على عدم الحصول على جدا عالية الدقة والكاميرات الرقمية باهظة الثمن. باستخدام هذه الطريقة، واحد يلتقط الصور المتسلسلة في مواقع مختلفة على طول X- و y محاور وبعد ذلك تلقائيا غرز معا باستخدام مجانية (على سبيل المثال، محرر الصور المركبة). والجدير بالذكر أن هذه الطريقة يمكن استخدامها لتقييم النوعي والكمي للتشجر شجيري في منطقة واسعة إلى حد ما.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا، وقد وصفت طريقتين لقياس مدى تشجر شجيري في الخلايا العصبية الناضجة ولدت حديثا باستخدام أساليب تلطيخ التقليدية جنبا إلى جنب مع RTI وEDFI. الحصول على صور عالية الدقة من الخلايا العصبية يوفر وسيلة مفيدة للغاية لاختبار الآثار الضارة للاضطرابات العصبية، وبالتالي، يوفر و…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by grants from the LuMind Foundation, Research Down Syndrome, and the Alzheimer’s Association (AS). CP was partially supported by a faculty development grant from the College of Nursing and Health Professions at Arkansas State University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Modified Golgi-cox staining solution | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 1x Developing Solution (Stock 10x) | Weill Cornell Medical College | NA | store at 4°C till use |
| 30% Sucrose, | Sigma | CAS # 57-50-1 | make fresh in ddH2O |
| 0.3% Gelatin | Sigma | CAS # 9000-70-8 | NA |
| Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%) | Sigma | CAS 603-003-00-5 | NA |
| Xylene | Sigma | CAS # 1330-20-7 | NA |
| DPX Medium | EMS | #13510 | NA |
| Superfrost (+) white | Electron Microscopy Sciences | 71869-10 | NA |
| Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059) | VWR | #4811-703 | NA |
| DCX Antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-8066 | 4 C |
| DAB | Sigma | CAS Number 91-95-2 | -20 |
| OCT | Tissue-tek | 4583 | NA |
| Tris | Sigma | CAS Number 77-86-1 | NA |
| ABC Lite | Vector | PK4000 | NA |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Digital Camera | Nikon | DS-Ri1 | |
| 12 bit Camera | QImaging | 01 MBF2000RF-CLR-12 | |
| Neurolucida System | MBF Bioscience | V.10 | |
| Image Composite Editor | Microsoft | 1.4.4.0 | |
| NIS Elements | Nikon | F 3.0 | |
| Image Pro Plus | Mediacy | Versin 7.00 |
References
- Bosch, M., Hayashi, Y. Structural plasticity of dendritic spines. Curr Opin Neurobiol. 22 (3), 383-388 (2012).
- Isaac, J. T. The synapse: center stage for many brain diseases. The Journal of Physiology. 587 (4), 727-729 (2009).
- Sheng, M., Sabatini, B. L., Südhof, T. C. Synapses and Alzheimer’s disease. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , a005777 (2012).
- Alvarez, V. A., Sabatini, B. L. Anatomical and physiological plasticity of dendritic spines. Annu Rev Neurosci. 30, 79-97 (2007).
- Huttenlocher, P. R. Dendritic development in neocortex of children with mental defect and infantile spasms. Neurology. 24 (3), 203-210 (1974).
- Marin-Padilla, M. Double origin of the pericellular baskets of the pyramidal cells of the human motor cortex: a Golgi study. Brain Res. 38 (1), 1-12 (1972).
- Dang, V., et al. Formoterol, a long-acting β2 adrenergic agonist, improves cognitive function and promotes dendritic complexity in a mouse model of Down syndrome. Biol Psychiatry. 75 (3), 179-188 (2014).
- Dobrović, B., Curić, G., Petanjek, Z., Heffer, M. Dendritic morphology and spine density is not altered in motor cortex and dentate granular cells in mice lacking the ganglioside biosynthetic gene B4galnt1 A quantitative Golgi cox study. Coll Antropol. 35 (Suppl 1), 25-30 (2011).
- Dijkmans, T. F., van Hooijdonk, L. W., Fitzsimons, C. P., Vreugdenhil, E. The doublecortin gene family and disorders of neuronal structure. Cent Nerv Syst Agents Med Chem. 10 (1), 32-46 (2010).
- Guerra, E., Pignatelli, J., Nieto-Estévez, V., Vicario-Abejón, C. Transcriptional regulation of olfactory bulb neurogenesis. Anat Rec. 296 (9), 1364-1382 (2013).
- Imayoshi, I., Shimojo, H., Sakamoto, M., Ohtsuka, T., Kageyama, R. Genetic visualization of notch signaling in mammalian neurogenesis. Cell Mol Life Sci. 70 (12), 2045-2057 (2013).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. J Vis Exp. (65), 3564-3510 (2012).
- Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. The Golgi-Cox method. Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).
- Juraska, J. M. Sex differences in developmental plasticity in the visual cortex and hippocampal dentate gyrus. Prog Brain Res. 61, 205-214 (1984).
- Gao, X., Deng, P., Zao, C. X., Chen, J. Moderate traumatic brain injury causes acute dendritic and synaptic degeneration in the hippocampal dentate gyrus. PLoS One. 6 (9), e24566 (2011).
- Zhang, L., Hernández, V. S., Estrada, F. S., Luján, R. Hippocampal CA field neurogenesis after pilocarpine insult: The hippocampal fissure as a neurogenic niche. J Chem Neuroanat. 56, 45-57 (2014).
- Merz, K., Lie, D. C. Evidence that Doublecortin is dispensable for the development of adult born neurons in mice. PLoS One. 8 (5), e62693 (2013).
- Hussaini, S. M., et al. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. (78), (2013).
