Evaluación de la arborización dendrítica en el giro dentado de la región del hipocampo en ratones

Summary

We describe two methods for visualization and quantification of dendritic arborization in the hippocampus of mouse models: real-time and extended depth of field imaging. While the former method allows sophisticated topographical tracing and quantification of the extent of branching, the latter allows speedy visualization of the dendritic tree.

Abstract

Dendritic arborization has been shown to be a reliable marker for examination of structural and functional integrity of neurons. Indeed, the complexity and extent of dendritic arborization correlates well with the synaptic plasticity in these cells. A reliable method for assessment of dendritic arborization is needed to characterize the deleterious effects of neurological disorders on these structures and to determine the effects of therapeutic interventions. However, quantification of these structures has proven to be a formidable task given their complex and dynamic nature. Fortunately, sophisticated imaging techniques can be paired with conventional staining methods to assess the state of dendritic arborization, providing a more reliable and expeditious means of assessment. Below is an example of how these imaging techniques were paired with staining methods to characterize the dendritic arborization in wild type mice. These complementary imaging methods can be used to qualitatively and quantitatively assess dendritic arborization that span a rather wide area within the hippocampal region.

Introduction

Alteraciones dinámicas en el número y la estructura de las sinapsis son características de desarrollo, el envejecimiento, y numerosos trastornos neurodegenerativos ^1-3. La capacidad de las neuronas para recibir e integrar la información sináptica depende de la morfología dendrítica y alteraciones dinámicas en las conexiones sinápticas. De hecho, existe una correlación positiva entre la espina dendrítica y el número de sinapsis, que tanto el impacto de la función cognitiva ^4. Por lo tanto, no es sorprendente que decrementos en número de la espina dendrítica se han asociado con la disfunción cognitiva en un número de trastornos neurológicos ^5-7, lo que provocó un gran interés en la cuantificación de la espina dendrítica. Sin embargo, la cuantificación de la densidad de la espina sigue siendo un tiempo y tarea tediosa, que no genera información útil con respecto a la topografía y la distribución de las sinapsis en todo el árbol dendrítico. Afortunadamente, los métodos de tinción (por ejemplo, Golgi-Cox y doublecortin (DCX)), en relacióncon sofisticadas técnicas de imagen se puede utilizar para superar las barreras actuales y producir imágenes de alta resolución de la arborización dendrítica de una manera fiable y rápida. Si bien el método de tinción de Golgi-Cox se puede implementar para evaluar el estado de la arborización dendrítica en todas las neuronas ^8, DCX puede desplegarse para etiquetar las neuronas recién nacidas en particular en el giro dentado y la zona subventricular ^9, una consideración importante dado que la neurogénesis ocurre tanto estas regiones a lo largo de la vida útil ^10,11.

Después de la tinción, dos métodos de imagen fueron desplegados para evaluar las características dendríticas: i) una imagen en tiempo real (RTI) y ii) de profundidad ampliada de la imagen de campo (EDFI). La técnica de RTI proporciona un medio para rastrear y cuantificar la longitud y orden de arborización largo de los segmentos y ramas dendríticas individuales. Por lo tanto, le permite a uno para estimar el área total y el volumen ocupado por cada árbol dendrítico. Más specifically, en el método RTI el usuario identifica continuamente los segmentos y reenfoca iterativamente como la neurona software de rastreo recoge las x, y, z y las coordenadas de la estructura dendrítica y reconstruye la trayectoria de la estructura dendrítica en 3D. Comparativamente, el método EDFI proporciona un medio más bien simples y rápidos para evaluar la densidad dendríticas en muestras de tejido en lugar de espesor mediante la generación de una imagen compuesta, proporcionando información sobre todo el eje z. Para ello, el usuario registra los archivos de vídeo de alta definición de todo el espesor de la sección y, a continuación utiliza el software para buscar los fotogramas de vídeo para identificar los puntos en el que un píxel es completamente enfocado. Posteriormente, los píxeles enfocados se fusionan e integran en una alta resolución, imagen 2D compuesta. Esta imagen compuesta contiene todos los píxeles que eran de enfoque, independientemente de su posición en el eje z. Análisis cualitativo y cuantitativo de estas imágenes en 2D se puede utilizar posteriormente para determinar la densidadde ramificación dendrítica en cada campo.

Por último, se presenta un método panorámica para generar imágenes de muy alta resolución para el análisis y evaluación de las dendritas en toda una región de interés. Esta técnica se puede implementar para superar la falta de acceso a muy alta resolución y cámaras digitales caras. Usando este método, uno capta imágenes en serie en diferentes lugares a lo largo de los ejes x e y ejes y luego automáticamente puntadas juntos usando un programa gratuito (por ejemplo, Imagen Composite Editor). En particular, este método se puede utilizar para la evaluación cualitativa y cuantitativa de arborización dendrítica en una zona bastante amplia.

Protocol

NOTA: Los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con las normas éticas aprobadas por el Comité de Investigación Animal de la Sistema de Salud de Asuntos de Veteranos de Palo Alto. 1. Golgi-Cox tinción La extracción de cerebro y tinción En la primera jornada, profundamente anestesiar a los ratones con 100 mg / kg de ketamina y 10 mg / kg de xilazina antes de la eutanasia a través desangrado. Retire con cuidado la bóveda craneal y diseccionar el cerebr…

Representative Results

La extensión de la arborización derivada de células granulares dentadas existentes y recién nacidos se analizó en ratones de tipo salvaje utilizando Golgi-Cox o tinción DCX (Figura 1). Se encontraron segmentos dendríticos de células DCX-positivas que ser 13 a 36 micras de largo. La distribución normal de la longitud dendrítica se probó mediante la prueba de Kolmogorov-Smirnov (D = 0,1217, p <0,01, Liliefors p <0,001; las figuras 4 y 5). <p class="jo…

Discussion

Aquí, dos métodos se describieron para cuantificar el grado de arborización dendrítica en las neuronas maduras y recién nacidos utilizando métodos de tinción convencionales en conjunción con RTI y EDFI. La adquisición de imágenes de alta resolución de las neuronas proporciona un método extremadamente útil para probar los efectos perjudiciales de los trastornos neurodegenerativos y, a su vez, proporciona un medio para evaluar las estrategias terapéuticas que se dirigen a las neuronas del hipocampo.

<p c…

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Modified Golgi-cox staining solution	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
1x Developing Solution (Stock 10x)	Weill Cornell Medical College	NA	store at 4°C till use
30% Sucrose,	Sigma	CAS # 57-50-1	make fresh  in ddH2O
0.3% Gelatin	Sigma	CAS # 9000-70-8	NA
Graded Ethanol Solutions (20%, 30%, 40%, 50%, 80%. 90%, 95%. 100%)	Sigma	CAS 603-003-00-5	NA
Xylene	Sigma	CAS # 1330-20-7	NA
DPX Medium	EMS	#13510	NA
Superfrost (+) white	Electron Microscopy Sciences	71869-10	NA
Coverslip 22x50mm (VWR #48393-059)	VWR	#4811-703	NA
DCX Antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-8066	4 C
DAB	Sigma	CAS Number 91-95-2	-20
OCT	Tissue-tek	4583	NA
Tris	Sigma	CAS Number 77-86-1	NA
ABC Lite	Vector	PK4000	NA
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope	Nikon	Eclipse 80i
Digital Camera	Nikon	DS-Ri1
12 bit Camera	QImaging	01 MBF2000RF-CLR-12
Neurolucida System	MBF Bioscience	V.10
Image Composite Editor	Microsoft	1.4.4.0
NIS Elements	Nikon	F 3.0
Image Pro Plus	Mediacy	Versin 7.00