Facial Nerve aksotomi i mus: en model til at studere motoneuron Reaktion på Skade

Summary

We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.

Abstract

Målet med denne kirurgiske protokol er at udsætte den facial nerve, som innerverer ansigtets muskulatur på sin udgang fra stylomastoid foramen og enten skære eller knuse det at inducere perifer nerveskade. Fordele ved denne operation er sin enkelhed, høj reproducerbarhed, og den manglende effekt på vitale funktioner eller mobilitet fra den efterfølgende ansigtslammelse, hvilket resulterer i en relativt mild kirurgisk resultat i forhold til andre nerveskade modeller. En væsentlig fordel ved anvendelse af en kraniel nerveskade model er, at motorneuroner opholde sig i en relativt homogen population i facial motor kerne i pons, forenkle undersøgelse af motorisk cellelegemer. På grund af den symmetriske natur af facial nerve innervation og manglende krydstale mellem ansigtets motoriske kerner kan operationen udføres ensidigt med unaxotomized side tjener som en parret intern kontrol. En række analyser kan udføres postoperativt for at vurdereer den fysiologiske reaktion, hvis enkeltheder er uden for rammerne af denne artikel. For eksempel kan genvinding af muskelfunktion tjene som en adfærdsmæssig markør for reinnervation eller de motoriske neuroner kan kvantificeres at måle celleoverlevelse. Derudover kan motoneuroner nøjagtigt taget med laser mikrodissektion for molekylær analyse. Fordi facial nerve axotomi er minimalt invasiv og veltolereret, kan det anvendes på en lang række af genetisk modificerede mus. Desuden kan denne operation model anvendes til at analysere effektiviteten af ​​perifere nerveskade behandlinger. Facial nerveskade tilvejebringer et middel til at undersøge ikke blot motoneuroner, men også svarene fra det centrale og perifere glia mikromiljø, immunsystemet, og målet muskulatur. Den facial nerve skade model er en bredt accepteret perifer nerveskade, der fungerer som et effektivt redskab til at studere nerveskade og regenerering.

Introduction

Mange perifere modeller nerveskade eksisterer, men en, der skiller sig ud for studiet af motorneuroner er ansigtets nerve axotomi model. Den facial nerve, også kendt som kranienerver VII, stammer i pons og innerverer musklerne i ansigtsudtryk ^1,2. I denne kirurgisk protokol er den facial nerve eksponeret ved sin exit fra stylomastoid foramen og enten er skåret eller knust. Sværhedsgraden af nerveskade kan klassificeres efter Sunderland ³ klassifikationer, hvilket adskiller den skade baseret på intakthed af axoner, endoneurium, perineuriet og epineurium, som er bindevæv lag, sekventielt wrap rundt Axon bundter. I crush skade (axonotmesis), er axoner adskilles, men perineuriet og epineurium bevares. Komplet funktionel genvinding fra facial nerve crush forekommer i omkring 11 dage, fordi det intakte nerve kappe tjener som en ledning, inden for hvilken axoner regrow ^4,5. PåDerimod i snittet skade (neurotmesis), axoner og alle 3 bindevæv lag adskilles, og hele distale nerve skal regrow at genoprette muskulatur innervation. Kirurgisk genetablering af epineurium udføres ofte i humane patienter med nerve transektion skader dog genopretnings- resultater er sjældent optimalt. Yderligere undersøgelse er nødvendig for at forstå, hvorfor den nerve ikke regrow til sit mål, og hvilke behandlinger kan anvendes til at forbedre og fremskynde regenerative proces.

Der er mange fordele ved at studere nerveskade ved hjælp af facial nerve axotomi model. For det første facial nerve axotomi procedure er hurtig, nem og meget reproducerbar; og den resulterende lammelse af ansigtsmuskler ikke påvirke vitale funktioner og tolereres godt af dyret. Da dette er en kranienerver skade model, studere motoneuron celle organer er forenklet, fordi motoneuroner opholde sig i en forholdsvis homogen befolkning i the facial motor kerne i pons. Befolkningen har forskellig baseret på subnuclear mønster i ansigtet motor kerne, da der er syv subnuclei hver enkelt at innerverer en bestemt gruppe af muskler, så inde i kernen forskelle i respons på axotomi kan påvirke resultaterne ^2,6,7.

En stor fordel af ansigtets nerve skade modellen er, at den unaxotomized side kan tjene som en parret intern kontrol, fordi nerve innervation er meget symmetrisk og der er ingen crosstalk mellem ansigtets motoriske kerner ^8. En anden fordel ved anvendelse af denne kirurgiske fremgangsmåde er den manglende direkte trauma på CNS eller afbrydelse af blod-hjerne barrieren ^9. Komplikationer såsom overdreven blødning og infektion er sjældne med denne procedure.

En række analyser kan udføres for at vurdere den fysiologiske reaktion på nerveskade. Udvindingen af ​​øjet blinkerefleksen og whisker aktivitet kan anvendes som en adfærdsmæssigmåling af funktionel genopretning ^10,11. Videooptagelse af vibrissae aktivitet er i øjeblikket den mest effektive metode til påvisning af inddrivelse af facial nerve innervation ^12,13. Efter eutanasi kan histologisk analyse af hjernestammen udføres på motoneuron cellelegemer i facial motor kernen. Den facial motor kerne er opdelt i syv subnuclei, der er specifikke for visse ansigtsmuskler, der giver mulighed for differentieret undersøgelse af svarene til skade ^2,6. Facial motorneuroner kan tælles at kvantificere celleoverlevelse eller immunhistokemi kan anvendes til at identificere biomarkører og specifikke cellepopulationer ^14. Den facial motor kerne kan præcist mikrodissekeres hjælp af laser capture for molekylær analyse af den cellulære respons på nerveskade ^15,16. Virkningerne af den facial nerve axotomi kan analyseres i den motoriske hjernebark ^17,18. Desuden kan nerven dissekeres at studere Wallerian degeneration ¹⁹ elleraxon regeneration ^20, og musklerne kan fjernes for at studere neuromuskulære junctions ^21. Facialisnerven axotomi kan også anvendes til at studere de medfølgende centrale og perifere gliaceller ^22, målrette muskulatur ²¹ og immunsystemet ^23. Selvom meget er blevet opnået i at studere facial nerve axotomi model ^24, er yderligere undersøgelse af perifer nerveskade påkrævet, fordi nerveskader er et væsentligt problem for patienter og nuværende behandlinger ikke at producere optimale resultater. Denne model er et kraftfuldt værktøj til at undersøge den fysiologiske reaktion på nerveskade og analysere effektiviteten af ​​nerve regenerering behandlinger.

Protocol

Alle procedurer udført godkendes af Indiana University School of Medicine Institutional Animal Care og brug Udvalg og følg National Institute of retningslinjer Sundhed. 1. Kirurgisk teknik Oprethold aseptisk teknik under denne procedure ved hjælp af sterile handsker, instrumenter og et sterilt kirurgisk felt ifølge NIH retningslinjer 25. Steriliseres værktøjer, før du begynder kirurgi ved autoklavering dem (se tabel af specifikke reagenser / udstyr</stron…

Representative Results

Efter facial nerve axotomi udføres, motoneuron tab opstår som følge af skaden. Motoneuron overlevelse efter skade afhænger af mange variabler, såsom køn, dyr alder på tidspunktet for kirurgi, og tidspunkterne, hvor de motoriske tæller er færdig, og Moran og Graeber anmeldelse 24 og Jinno og Yamada anmeldelse 22 både opsummere motoneuron overlevelsesdata. Typisk omkring 86% af motorneuroner overleve ved 28 dage efter axotomi 14,15,26. Kinetik for motoneuron tab er beskrevet i Se…

Discussion

The critical step for this protocol is positioning the mouse properly before surgery is begun. If the mouse is not lying flat on its side, the ear is not taped at the correct angle, or the incision is made in an incorrect location, then finding the facial nerve becomes much more difficult. When this technique is mastered, surgeries will take only minutes per mouse.

Either sutures, glue, or wound clips can be used to close the wound. Wound clips are preferred because of the small size of incis…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
Stereo Microscope	Leica	M60
Labeling tape	Fisher Scientific	15-952
Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5cm/5mm cutting edge	Fine Science Tools	15003-08	Sterilize before use
Dumont #5/45 Forceps – Standard tips/Angled 45°/Dumoxel/11cm	Fine Science Tools	11251-35	Sterilize before use
Michel Suture Clips – 7.5mm x 1.75 mm	Fine Science Tools	12040-01	Described as "wound clip" in protocol, sterilize before use
Hagenbarth Cross Action Wound Clip Applier 5"	George Tiemann & Co	160-910	Used to apply wound clip, sterilize before use
Michel Suture Clip Applicator & Remover – For 7.5 mm Clips	Fine Science Tools	12029-12	Used to remove wound clip
0.9% Sodium Chloride Injection, USP	Hospira	0409-4888-10
Betadine, 16 oz, with dispenser	Fisher Scientific	19-027132
70% Ethanol
Glass Bead Sterilizer