Axotomía nervio facial en ratones: un modelo para estudiar las motoneuronas respuesta a la lesión
Summary
We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.
Abstract
El objetivo de este protocolo quirúrgico es exponer el nervio facial, que inerva la musculatura facial, a su salida del foramen estilomastoideo y cortado o aplastarlo para inducir la lesión del nervio periférico. Ventajas de esta cirugía son su simplicidad, alta reproducibilidad, y la falta de efecto en las funciones vitales o la movilidad de la parálisis facial posterior, lo que resulta en un resultado quirúrgico relativamente leve en comparación con otros modelos de lesión del nervio. Una ventaja importante de utilizar un modelo de lesión del nervio craneal es que las motoneuronas residen en una población relativamente homogénea en el núcleo motor facial en la protuberancia, simplificando el estudio de los cuerpos celulares de las motoneuronas. Debido a la naturaleza simétrica de la inervación del nervio facial y la falta de diafonía entre los núcleos motores faciales, la operación se puede realizar de manera unilateral con el lado unaxotomized que sirve como un control interno emparejado. Una variedad de análisis se puede realizar después de la operación de asnoss la respuesta fisiológica, los detalles de los cuales están más allá del alcance de este artículo. Por ejemplo, la recuperación de la función muscular puede servir como un marcador de comportamiento para la reinervación, o las motoneuronas puede ser cuantificado para medir la supervivencia celular. Además, las neuronas motoras se pueden capturar con precisión utilizando microdisección por láser para el análisis molecular. Debido a que la axotomía del nervio facial es mínimamente invasiva y bien tolerada, puede ser utilizado en una amplia variedad de ratones modificados genéticamente. Además, este modelo de la cirugía puede ser utilizado para analizar la eficacia de los tratamientos de lesión del nervio periférico. Lesión del nervio facial proporciona un medio para investigar no sólo las motoneuronas, sino también las respuestas del microambiente central y periférico glial, el sistema inmunológico, y la musculatura de destino. El modelo de lesión del nervio facial es un modelo de lesión de nervio periférico ampliamente aceptado que sirve como una poderosa herramienta para el estudio de la lesión del nervio y la regeneración.
Introduction
Existen muchos modelos de lesión del nervio periférico, pero uno que se destaca por el estudio de las motoneuronas es el modelo de axotomía del nervio facial. El nervio facial, también conocido como nervio craneal VII, se origina en la protuberancia y inerva los músculos de la expresión facial 1,2. En este protocolo quirúrgico, el nervio facial está expuesto en su salida del foramen estilomastoideo y ya sea corta o se tritura. La gravedad de la lesión del nervio puede clasificarse siguiendo las Sunderland 3 clasificaciones, que diferencia el daño basada en la integridad de los axones, endoneuro, perineuro y epineurio, que son capas de tejido conectivo que secuencialmente se envuelven alrededor de los haces de axones. En la lesión por aplastamiento (axonotmesis), los axones se cortan, pero el perineuro y epineurio se conservan. Recuperación funcional completa de aplastamiento del nervio facial se produce en alrededor de 11 días debido a que la vaina del nervio intacto sirve como un conducto en el que los axones vuelven a crecer 4,5. Porotro lado, en la lesión de corte (neurotmesis), los axones y las 3 capas de tejido conectivo se separó, y todo el nervio distal debe volver a crecer para restaurar la inervación musculatura. Reconexión quirúrgica de la epineurio se realiza a menudo en pacientes humanos con lesiones de la transección del nervio, sin embargo los resultados de la recuperación rara vez son óptimas. Se requieren más estudios para comprender por qué el nervio no puede volver a crecer a su objetivo y qué terapias se puede emplear para mejorar y acelerar el proceso de regeneración.
Hay muchas ventajas para el estudio de la lesión del nervio utilizando el modelo de axotomía del nervio facial. En primer lugar, el procedimiento axotomía del nervio facial es rápido, fácil y altamente reproducible; y la parálisis resultante de los músculos faciales no afecta a las funciones vitales y es bien tolerado por el animal. Debido a que este es un modelo de lesión del nervio craneal, el estudio de los cuerpos celulares de las neuronas motoras se simplifica porque las motoneuronas residen en una población relativamente homogénea en ªe núcleo motor facial en la protuberancia. La población se diferencia en base al patrón subnuclear dentro del núcleo motor facial, ya que hay siete subnúcleos cada uno específico para que inervan un grupo específico de músculos, por lo que las diferencias subnucleares en respuesta a axotomía puede afectar los resultados de 2,6,7.
Una ventaja importante del modelo de lesión del nervio facial es que el lado unaxotomized puede servir como un control interno emparejado porque la inervación del nervio es altamente simétrica y no hay diafonía entre los núcleos motores faciales 8. Otra ventaja de utilizar este método quirúrgico es la falta de un traumatismo directo al SNC o la interrupción de la barrera hematoencefálica 9. Las complicaciones como sangrado excesivo y la infección son raros con este procedimiento.
Una variedad de análisis se puede realizar para evaluar la respuesta fisiológica a la lesión del nervio. La recuperación del reflejo del parpadeo del ojo y la actividad de la barba se puede utilizar como un comportamientomedida de 10,11 recuperación funcional. La grabación de vídeo de la actividad vibrisas es actualmente el método más poderoso para la detección de la recuperación de la inervación del nervio facial 12,13. Después de la eutanasia, el análisis histológico del tronco cerebral se puede realizar en los cuerpos celulares de las neuronas motoras en el núcleo motor facial. El núcleo motor facial se subdivide en siete subnúcleos, cada uno específico para ciertos músculos faciales, lo que permite el examen diferencial de las respuestas a la lesión 2,6. Las motoneuronas faciales pueden ser contados para cuantificar la supervivencia celular, o inmunohistoquímica pueden utilizarse para identificar biomarcadores y poblaciones de células específicas 14. El núcleo motor facial se puede microdissected con precisión utilizando captura por láser para el análisis molecular de la respuesta celular a la lesión del nervio 15,16. Impactos de la axotomía del nervio facial pueden ser analizados en la corteza motora 17,18. Además, el nervio puede ser diseccionado para estudiar la degeneración walleriana 19 oaxón de regeneración 20, y los músculos se pueden quitar para estudiar las uniones neuromusculares 21. La axotomía del nervio facial también puede ser utilizado para estudiar las células gliales centrales y periféricos que se acompañan 22, el objetivo de la musculatura 21, y el sistema inmune respuesta 23. Aunque se ha avanzado mucho en el estudio del modelo de axotomía del nervio facial 24, se requiere un mayor estudio de la lesión del nervio periférico, porque el daño nervioso es un problema importante para los pacientes y los tratamientos actuales no producen resultados óptimos. Este modelo es una poderosa herramienta para el examen de la respuesta fisiológica a la lesión del nervio y el análisis de la efectividad de las terapias de regeneración del nervio.
Protocol
Representative Results
Discussion
The critical step for this protocol is positioning the mouse properly before surgery is begun. If the mouse is not lying flat on its side, the ear is not taped at the correct angle, or the incision is made in an incorrect location, then finding the facial nerve becomes much more difficult. When this technique is mastered, surgeries will take only minutes per mouse.
Either sutures, glue, or wound clips can be used to close the wound. Wound clips are preferred because of the small size of incis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is funded by NIH RO1 NS 40433 (K.J.J.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stereo Microscope | Leica | M60 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | 15-952 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5cm/5mm cutting edge | Fine Science Tools | 15003-08 | Sterilize before use |
| Dumont #5/45 Forceps – Standard tips/Angled 45°/Dumoxel/11cm | Fine Science Tools | 11251-35 | Sterilize before use |
| Michel Suture Clips – 7.5mm x 1.75 mm | Fine Science Tools | 12040-01 | Described as "wound clip" in protocol, sterilize before use |
| Hagenbarth Cross Action Wound Clip Applier 5" | George Tiemann & Co | 160-910 | Used to apply wound clip, sterilize before use |
| Michel Suture Clip Applicator & Remover – For 7.5 mm Clips | Fine Science Tools | 12029-12 | Used to remove wound clip |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Betadine, 16 oz, with dispenser | Fisher Scientific | 19-027132 | |
| 70% Ethanol | |||
| Glass Bead Sterilizer |
References
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