Axotomy פנים עצב של עכברים: דגם לחקר תגובת Motoneuron לפגיעה
Summary
We present a surgical protocol detailing how to perform a cut or crush axotomy on the facial nerve in the mouse. The facial nerve axotomy can be employed to study the physiological response to nerve injury and test therapeutic techniques.
Abstract
המטרה של פרוטוקול כירורגית זו היא לחשוף את עצב הפנים, שמעצבב את שרירי פנים, ביציאתו מנקב stylomastoid וגם לחתוך או לרסק אותו כדי לגרום לפגיעה עצבית היקפית. יתרונותיו של ניתוח זה הם הפשטות שלו, שחזור גבוה, וחוסר ההשפעה על תפקודים חיוניים או ניידות משיתוק הפנים שלאחר מכן, ובכך וכתוצאה מכך תוצאות ניתוחיות קלות יחסית בהשוואה לדגמי פגיעה עצבית אחרים. יתרון עיקרי של שימוש במודל פגיעה בעצב גולגולת הוא שmotoneurons מתגורר באוכלוסייה הומוגנית יחסית בגרעין המוטורי הפנים בפונס, לפשט את המחקר של גופי תא motoneuron. בגלל האופי סימטרי של עצבוב עצב פנים וחוסר crosstalk בין הגרעינים מוטורי פנים, הפעולה יכולה להתבצע באופן חד צדדי עם צד unaxotomized משמש כבקרה פנימית לזווג. מגוון רחב של ניתוחים ניתן לבצע לאחר הניתוח לישבניםזה התגובה הפיזיולוגית, אשר פרטיו הן מעבר להיקף של מאמר זה. לדוגמא, התאוששות של תפקוד שרירים יכולה לשמש כסמן להתנהגות reinnervation, או ניתן לכמת motoneurons למדוד הישרדות תא. בנוסף, motoneurons ניתן ללכוד במדויק באמצעות microdissection לייזר לניתוח מולקולרי. בגלל axotomy עצב הפנים הוא פולשנית ונסבלת היטב, זה יכול להיות מנוצל על מגוון רחב של עכברים מהונדסים גנטי. כמו כן, מודל ניתוח זה יכול לשמש כדי לנתח את האפקטיביות של טיפולי פגיעה עצבית היקפיים. פגיעה בעצב פנים מספקת אמצעי לחקירה לא רק motoneurons, אלא גם את תגובותיהם של מייקרו-הסביבה המרכזית וההיקפי גליה, המערכת חיסונית, ושרירי יעד. מודל פגיעה בעצב פנים הוא מודל פגיעה עצבי היקפי מקובל שמשמש ככלי רב עוצמה ללימוד פגיעה עצבית והתחדשות.
Introduction
מודלים פגיעה עצבית היקפיים רבים קיימים, אבל אחד שבולט לחקר motoneurons הוא מודל axotomy עצב הפנים. עצב הפנים, הידוע גם בעצב גולגולת VII, מקורו בגשר המוח ומעצבב את שרירי הבעה בפנים 1,2. בפרוטוקול זה כירורגית, עצב הפנים חשוף ביציאתו מנקב stylomastoid וגם לחתוך או כתוש. חומרת פגיעה עצבית יכולה להיות מסווגת הבאה סנדרלנד 3 סיווגים, המבדיל את הפגיעה המבוססת על שלמותו של אקסונים, endoneurium, perineurium, וepineurium, שהם שכבות רקמת חיבור שרצף לעטוף את חבילות האקסון. בפציעה למחוץ (axonotmesis), אקסונים, נותקו, אבל perineurium וepineurium נשמרים. התאוששות תפקודית מלאה מלמעוך עצב פנים מתרחשת בכ -11 ימים בגלל נדן העצב שלם משמש כצינור שבתוכו האקסונים לגדל מחדש 4,5. בהיד השנייה, בפציעת החתך (neurotmesis), אקסונים וכל 3 שכבות רקמת החיבור נותקו, והעצב הדיסטלי כולו צריך לגדל מחדש כדי לשחזר עצבוב שרירים. חיבור מחדש של כירורגי epineurium מבוצע לעתים קרובות בחולים אנושיים עם פציעות חיתוך רוחב עצב, אולם תוצאות ההתאוששות הן לעתים רחוקות אופטימליות. נדרש מחקר נוסף על מנת להבין למה העצב לא מצליח להצמיח מחדש ליעד שלו ויכולים להיות מועסק מה טיפולים כדי לשפר ולהאיץ את תהליך ההתחדשות.
ישנם יתרונות רבים ללימוד פגיעה עצבית באמצעות מודל axotomy עצב הפנים. ראשית, הליך axotomy עצב הפנים הוא מהיר, קל, ומאוד לשחזור; והשיתוק כתוצאה של שרירי הפנים אינו משפיע פונקציות חיוניות ונסבל היטב על ידי בעלי החיים. כיוון שמדובר במודל פגיעה בעצב גולגולת, לומד את גופי תא motoneuron הוא פשוטים כי motoneurons מתגורר באוכלוסייה הומוגנית יחסית בהגרעין מוטורי פנים דואר בפונס. האוכלוסייה אינה שונה המבוססת על תבנית subnuclear בתוך הגרעין המוטורי הפנים, כפי שיש שבע subnuclei כל ספציפי לinnervating קבוצה ספציפית של שרירים, ולכן הבדלי subnuclear בתגובה לaxotomy עשויים להשפיע על תוצאות 2,6,7.
יתרון עיקרי של מודל פגיעה בעצב פנים הוא שצד unaxotomized יכול לשמש כבקרה פנימית לזווג כי עצבוב העצב הוא סימטרי מאוד ואין crosstalk בין הגרעינים המוטוריים הפנים 8. יתרון נוסף של שימוש בשיטה ניתוחית זו הוא חוסר טראומה ישירה למערכת העצבים המרכזית או השיבוש של מחסום דם מוח 9. סיבוכים כגון דימום וזיהום מוגזמים הם נדירים בהליך זה.
מגוון רחב של ניתוחים ניתן לבצע כדי להעריך את התגובה הפיזיולוגית לפגיעה בעצב. ההתאוששות של רפלקס מצמוץ עין ופעילות זיף יכולה לשמש כהתנהגותמדד של 10,11 החלמה התפקודי. הקלטת וידאו של פעילות vibrissae היא כיום השיטה החזקה ביותר לאיתור התאוששות של עצבוב עצב הפנים 12,13. לאחר המתת חסד, ניתוח היסטולוגית של גזע המוח יכול להתבצע על גופי תא motoneuron בתוך הגרעין המוטורי הפנים. הגרעין מוטורי הפנים מחולק לשבע subnuclei, כל ספציפי לשרירי פנים מסוימים, המאפשר לבדיקת ההפרש של תגובות לפציעה 2,6. ניתן לספור motoneurons פנים לכמת הישרדות תא, או אימונוהיסטוכימיה יכולה לשמש לזיהוי סמנים ביולוגיים ואוכלוסיות תאים ספציפיות 14. הגרעין מוטורי הפנים יכול להיות microdissected במדויק באמצעות לכידת לייזר לניתוח מולקולרי של התגובה התאית לפגיעה בעצב 15,16. השפעות של axotomy עצב הפנים ניתן לנתח בקליפת המוח המוטורי 17,18. כמו כן, העצב יכול להיות גזור ללמוד ניוון Wallerian 19 אוהתחדשות האקסון 20, ואת השרירים ניתן להסיר ללמוד צמתים עצביים-שרירית 21. גם axotomy עצב הפנים יכול לשמש כדי לחקור את תאי גליה מרכזיים והיקפיים הנלווים 22, למקד את המערכת החיסונית תגובת 23 שרירים 21, ו. למרות שדברים רבים הושג בלימוד מודל axotomy עצב פנים 24, נדרש מחקר נוסף של פגיעה עצבית היקפית כי נזק עצבי היא בעיה משמעותית עבור חולים וטיפולים שוטפים לא מצליחים לייצר תוצאות אופטימליות. מודל זה הוא כלי רב עוצמה לבחינת התגובה הפיזיולוגית לפגיעה בעצב וניתוח היעילות של טיפולי התחדשות עצבים.
Protocol
Representative Results
Discussion
The critical step for this protocol is positioning the mouse properly before surgery is begun. If the mouse is not lying flat on its side, the ear is not taped at the correct angle, or the incision is made in an incorrect location, then finding the facial nerve becomes much more difficult. When this technique is mastered, surgeries will take only minutes per mouse.
Either sutures, glue, or wound clips can be used to close the wound. Wound clips are preferred because of the small size of incis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is funded by NIH RO1 NS 40433 (K.J.J.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Stereo Microscope | Leica | M60 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | 15-952 | |
| Vannas-Tübingen Spring Scissors – Straight/Sharp/8.5cm/5mm cutting edge | Fine Science Tools | 15003-08 | Sterilize before use |
| Dumont #5/45 Forceps – Standard tips/Angled 45°/Dumoxel/11cm | Fine Science Tools | 11251-35 | Sterilize before use |
| Michel Suture Clips – 7.5mm x 1.75 mm | Fine Science Tools | 12040-01 | Described as "wound clip" in protocol, sterilize before use |
| Hagenbarth Cross Action Wound Clip Applier 5" | George Tiemann & Co | 160-910 | Used to apply wound clip, sterilize before use |
| Michel Suture Clip Applicator & Remover – For 7.5 mm Clips | Fine Science Tools | 12029-12 | Used to remove wound clip |
| 0.9% Sodium Chloride Injection, USP | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Betadine, 16 oz, with dispenser | Fisher Scientific | 19-027132 | |
| 70% Ethanol | |||
| Glass Bead Sterilizer |
References
- Kaufman, M., Bard, J. . The Anatomical Basis of Mouse Development. , (1999).
- Ashwell, K. The adult mouse facial nerve nucleus: morphology and musculotopic organization. Journal of Anatomy. 135, 531-538 (1982).
- Sunderland, S. A classification of peripheral nerve injuries producing loss of function. Brain : A Journal Of Neurology. 74, 491-516 (1951).
- Beahrs, T., Tanzer, L., Sanders, V. M., Jones, K. J. Functional recovery and facial motoneuron survival are influenced by immunodeficiency in crush-axotomized mice. Experimental Neurology. 221, 225-230 (2010).
- Mesnard, N. A., Haulcomb, M. M., Tanzer, L., Sanders, V., Jones, K. J. Delayed functional recovery in presymptomatic mSOD1G93A mice following facial nerve crush axotomy. Journal of Neurodegeneration & Regeneration. 4, 21-25 (2013).
- Komiyama, M., Shibata, H., Suzuki, T. Somatotopic representation of facial muscles within the facial nucleus of the mouse. A study using the retrograde horseradish peroxidase and cell degeneration techniques. Brain Behav Evol. 24, 144-151 (1984).
- Canh, M. Y., Serpe, C. J., Sanders, V., Jones, K. J. CD4(+) T cell-mediated facial motoneuron survival after injury: Distribution pattern of cell death and rescue throughout the extent of the facial motor nucleus. Journal of Neuroimmunology. 181, 93-99 (2006).
- Isokawa-Akesson, M., Komisaruk, B. Difference in projections to the lateral and medial facial nucleus: anatomically separate pathways for rhythmical vibrissa movement in rats. Exp Brain Res. 65, 385-398 (1987).
- Streit, W., Kreutzberg, G. Response of endogenous glial cells to motor neuron degeneration induced by toxic ricin. The Journal of Comparative Neurology. 268, 248-263 (1988).
- Serpe, C. J., Tetzlaff, J. E., Coers, S., Sanders, V., Jones, K. J. Functional recovery after facial nerve crush is delayed in severe combined immunodeficient mice. Brain, Behavior, And Immunity. 16, 808-812 (2002).
- Lal, D., et al. Electrical stimulation facilitates rat facial nerve recovery from a crush injury. Otolaryngology–Head And Neck Surgery. Official Journal Of American Academy Of Otolaryngology-Head And Neck Surgery. 139, 68-73 (2008).
- Tomov, T., et al. An Example of Neural Plasticity Evoked by Putative Behavioral Demand and Early Use of Vibrissal Hairs after Facial Nerve Transection. Experimental Neurology. 178, 207-218 (2002).
- Skouras, E., Angelov, D. N. Experimental studies on post-transectional facial nerve regrowth and functional recovery of paralyzed muscles of the face in rats and mice. Anatomy (International Journal of Experimental and Clinical Anatomy). 4, 1-27 (2010).
- Xin, J., et al. IL-10 within the CNS is necessary for CD4+ T cells to mediate neuroprotection). Brain, Behavior, And Immunity. 25, 820-829 (2011).
- Mesnard, N. A., Sanders, V. M., Jones, K. J. Differential gene expression in the axotomized facial motor nucleus of presymptomatic SOD1 mice. The Journal of Comparative Neurology. 519, 3488-3506 (2011).
- Mesnard, N. A., Alexander, T. D., Sanders, V. M., Jones, K. J. Use of laser microdissection in the investigation of facial motoneuron and neuropil molecular phenotypes after peripheral axotomy. Experimental Neurology. 225, 94-103 (2010).
- Franchi, G. Changes in motor representation related to facial nerve damage and regeneration in adult rats. Experimental Brain Research. 135, 53-65 (2000).
- Munera, A., Cuestas, D. M., Troncoso, J. Peripheral facial nerve lesions induce changes in the firing properties of primary motor cortex layer 5 pyramidal cells. Neuroscience. 223, 140-151 (2012).
- Liu, L., et al. Hereditary absence of complement C5 in adult mice influences Wallerian degeneration, but not retrograde responses, following injury to peripheral nerve. Journal of the Peripheral Nervous System. 4, 123-133 (1999).
- Ferri, C., Moore, F., Bisby, M. Effects of facial nerve injury on mouse motoneurons lacking the p75 low-affinity neurotrophin receptor. Journal of Neurobiology. 34, 1-9 (1997).
- Zhou, R. Y., Xu, J., Chi, F. L., Chen, L. H., Li, S. T. Differences in sensitivity to rocuronium among orbicularis oris muscles innervated by normal or damaged facial nerves and gastrocnemius muscle innervated by somatic nerve in rats: combined morphological and functional analyses. The Laryngoscope. 122, 1831-1837 (2012).
- Jinno, S., Yamada, J. Using comparative anatomy in the axotomy model to identify distinct roles for microglia and astrocytes in synaptic stripping. Neuron Glia Biology. 7, 55-66 (2011).
- Jones, K. J., Serpe, C. J., Byram, S. C., Deboy, C. A., Sanders, V. M. Role of the immune system in the maintenance of mouse facial motoneuron viability after nerve injury. Brain, Behavior, And Immunity. 19, 12-19 (2005).
- Moran, L. B., Graeber, M. B. The facial nerve axotomy model. Brain research. Brain research. 44, 154-178 (2004).
- Council, N. R. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , (2011).
- Serpe, C. J., Kohm, A. P., Huppenbauer, C. B., Sanders, V., Jones, K. J. Exacerbation of Facial Motoneuron Loss after facial nerve transection in severe combined immunodeficient (scid) mice. Neuroscience. 19, (1999).
- Mesnard-Hoaglin, N. A., et al. SOD1(G93A) transgenic mouse CD4(+) T cells mediate neuroprotection after facial nerve axotomy when removed from a suppressive peripheral microenvironment. Brain, Behavior, And Immunity. 40, 55-60 (2014).
- Wang, H., et al. Establishment and assessment of the perinatal mouse facial nerve axotomy model via a subauricular incision approach. Experimental Biology And Medicine. 237, 1249-1255 (2012).
- Sharma, N., Moeller, C. W., Marzo, S. J., Jones, K. J., Foecking, E. M. Combinatorial treatments enhance recovery following facial nerve crush. The Laryngoscope. 120, 1523-1530 (2010).
- Lieberman, D. M., Jan, T. A., Ahmad, S. O., Most, S. P. Effects of corticosteroids on functional recovery and neuron survival after facial nerve injury in mice. Archives of Facial Plastic Surgery. 13, 117-124 (2011).
- Serpe, C. J., Coers, S., Sanders, V. M., Jones, K. J. CD4+ T, but not CD8+ or B, lymphocytes mediate facial motoneuron survival after facial nerve transection. Brain, Behavior, And Immunity. 17, 393-402 (2003).
- Haulcomb, M. M., et al. Axotomy-induced target disconnection promotes an additional death mechanism involved in motoneuron degeneration in ALS transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. , (2014).
- Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (60), (2012).
- Richner, M., Bjerrum, O. J., Nykjaer, A., Vaegter, C. B. The spared nerve injury (SNI) model of induced mechanical allodynia in mice. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (54), (2011).
