Un dosage multi-détection pour moustiques vecteurs du paludisme
Summary
Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.
Abstract
Le complexe d'espèces Anopheles gambiae comprend le principal moustiques transmettent le paludisme en Afrique. Parce que ces espèces sont d'une telle importance médicale, plusieurs traits sont généralement caractérisés par des tests moléculaires pour aider dans les études épidémiologiques. Ces caractéristiques comprennent l'identification des espèces, la résistance aux insecticides, l'état de l'infection par le parasite, et de préférence d'hôte. Comme les populations du complexe Anopheles gambiae sont morphologiquement indiscernables, une réaction en chaîne de la polymérase (PCR) est traditionnellement utilisée pour identifier les espèces. Une fois l'espèce est connue, plusieurs essais sont régulièrement effectuées en aval pour élucider d'autres caractéristiques. Par exemple, des mutations connues sous le nom de KDR dans un gène par confèrent une résistance contre le DDT et les pyréthrinoïdes. En outre, les dosages d'enzyme-linked immunosorbent (ELISA) ou Plasmodium essais de PCR de détection de l'ADN du parasite sont utilisés pour détecter les parasites présents dans les tissus de moustiques. Enfin, une combination de la PCR et digestion de l'enzyme de restriction peut être utilisée pour élucider préférence de l'hôte (par exemple, humain contre le sang animal) par criblage de la farine de sang de moustique pour l'ADN spécifique à l'hôte. Nous avons développé un essai multi-détection (MDA) qui combine tous les tests mentionnés ci-dessus dans un seul multiplex 33SNPs réaction de génotypage pour 96 ou 384 échantillons à la fois. Parce que le MDA comprend de multiples marqueurs pour les espèces, Plasmodium détection, l'identification et de l'hôte dans le sang, la probabilité de générer des faux positifs ou négatifs est fortement réduite à partir de dosages précédentes comprenant un seul marqueur par trait. Ce test robuste et simple peut détecter ces traits de moustiques clés rentable et en une fraction du temps de tests existants.
Introduction
Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii et Anopheles gambiae sont les principaux vecteurs responsables de la transmission du paludisme en Afrique 1. Ces trois espèces sont morphologiquement indiscernables 2 et ne peuvent être distingués par des analyses moléculaires 9.3. En outre, il existe de nombreux tests en aval régulièrement menées pour faciliter les études de génétique épidémiologique et de la population. Il se agit notamment (1) un test de génotypage pour les îles de spéciation 10-12, (2) un test de génotypage reconnaissant SNP non synonymes dans le 1014 ème acide aminé en position de codon du gène par (la résistance knock-down, ou KDR, SNP) 13 -18, (3) la détection des parasites PCR 19-23, et (4) le dépistage de l'ADN spécifique de l'hôte dans estomacs de moustiques 24,25.
Nous avons développé un essai multi-détection (MDA) qui combine tous ces essais dans une réaction multiplex unique avec l'objectif d'unealyzing caractéristiques épidémiologiques importantes de vecteurs du paludisme en Afrique. Le dosage MDA comprend plusieurs marqueurs de détection (1) espèce (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii, ou autres (aucun des trois)), (2) la résistance aux insecticides représentés dans kdr SNP (deux L1014F et L1014S) , (3) la présence de deux grandes parasites du paludisme, Plasmodium falciparum et P. vivax, et (4) une source aviaire et six sang des hôtes mammifères.
Traditionnellement, ces essais ont été réalisés dans des réactions en chaîne par polymérase séparées. Lorsque tous ces essais sont effectués en utilisant une plate-forme PCR conventionnelle, il faut mener 8-10 dosages PCR de réaction et l'accompagnement des mesures d'électrophorèse en gel. Chaque réaction individuelle PCR de la préparation à la documentation des résultats prend 4-5 h, alors que la méthode MDA présenté ici prend environ 5 heures en totalité. Ceci est équivalent à un 90% d'économies sur les seuls coûts de main-d'œuvre. Le MDA présentée ici coûte 5 $par échantillon pour génotyper les 33 SNP. Ce est beaucoup moins cher que les tests à base de gel agarose simples, qui coûte environ 1,50 $ par échantillon. Dosages de détection toutes les caractéristiques couvertes par le MDA exigerait un minimum de 8 à 10 essais à base de gel agarose distincts à un coût de 12 à 15 $ par échantillon. En outre, le MDA diminue considérablement le risque de génération d'un faux positif ou négatif par l'utilisation d'au moins trois marqueurs pour chaque détection de parasite ou de la source hôte.
La plate-forme nous avons utilisé est pas limitée aux vecteurs du paludisme, mais peut être utilisé dans une grande variété d'applications telles que la médecine, de la médecine vétérinaire et de la biologie de base de 26 à 28. Des études approfondies d'association ou la génétique des populations études impliquant un grand nombre (dans l'ordre de 100s) des échantillons nécessitent des essais rentables dépistage de marqueurs multiples simultanément. La plupart des études qui utilisent deux ou plusieurs tests de PCR séparées puissent appliquer la MDA pour des résultats plus rapides à un coût moindre. </p>
Protocol
Representative Results
Discussion
Le MDA est composé de cinq étapes principales: amplification PCR, phosphatase alcaline de crevette (SAP) réaction, vulgarisation SNP, produit d'extension conditionnement et laser assistée par matrice de désorption / ionisation – temps de vol (MALDI-TOF) spectrométrie de masse 33-37. La première étape d'amplification PCR amplifie l'ADN flanquant chaque SNP sorte que l'ADN matrice assez sera disponible à l'étape d'extension SNP. La réaction de SAP neutralise dNTP non utilisée…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions les Drs. Anthony Cornel et Laura Norris à l'UC Davis et le Dr Katharina Kreppel à l'Université de Glasgow pour fournir des spécimens de moustiques de la Tanzanie. Nous remercions Mme Smita Das et le Dr Douglas Norris de la Johns Hopkins School of Public Health de partager des échantillons de moustiques de la Zambie. Nous remercions également M. Lee V. Millon au Laboratoire de génétique vétérinaire de formation sur la conception de l'essai. Ce travail a été soutenu par l'Institut national de la santé et accorder R01AI 078183 R21AI062929.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids. |
| MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP |
| iPLEX Gold Genotyping Reagent Set | Sequenom | 10158 | Reagents used for iPLEX assay including SAP kit. |
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