Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.
Die Anopheles gambiae Artenkomplex umfasst die wichtigsten Malariatragenden Mücken in Afrika. Da diese Arten solcher medizinischer Bedeutung, werden mehrere Merkmale in der Regel mit Hilfe molekularer Tests in epidemiologischen Studien zu helfen aus. Diese Eigenschaften umfassen Artbestimmung, Insektizidresistenz, Parasiteninfektion Status und Wirtspräferenz. Seit Populationen der Anopheles gambiae komplexe morphologisch nicht zu unterscheiden ist eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) traditionell genutzt, um Arten zu identifizieren. Sobald die Arten bekannt ist, werden mehrere Downstream-Tests routinemäßig durchgeführt, um weitere Eigenschaften zu erklären. Zum Beispiel Mutationen KDR in einer para-Gen bekannt Resistenz gegen DDT und Pyrethroid-Insektiziden. Zusätzlich werden Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) oder Plasmodium Parasiten-DNA Nachweis-PCR-Assays verwendet werden, um in Moskito Geweben vorhandenen Parasiten erkennen. Schließlich a combination der PCR und Restriktionsenzym verdaut, kann verwendet werden, um Wirtspräferenz (zB menschliche vs. Tierblut) durch Screening der Moskitoblutmehl für Host-spezifische DNA aufzuklären. Wir haben eine Mehrnachweisassay (MDA), die alle der oben genannten Assays zu einer Zeit verbindet, in einer einzigen Multiplex-Reaktion Genotypisierung 33SNPs für 96 oder 384 Proben entwickelt. Da die MDA umfasst mehrere Marker für Arten, Plasmodium Erkennung und Gastgeber Blut Identifikation, wird die Wahrscheinlichkeit der Erzeugung von falschen Positiven oder Negativen stark von vorherigen Tests, die nur eine Markierung pro Merkmal sind reduziert. Diese robusten und einfachen Test kann diese Schlüsselmoskito Eigenschaften kostengünstig und in einem Bruchteil der Zeit bestehender Assays.
Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii und Anopheles gambiae sind die wichtigsten Vektoren für Malaria-Übertragung in Afrika 1 verantwortlich. Diese drei Arten sind morphologisch nicht 2 und nur durch molekularen Assays 3-9 unterscheiden. Darüber hinaus gibt es viele Downstream-Tests routinemäßig durchgeführt, um epidemiologische und populationsgenetische Untersuchungen zu unterstützen. Diese umfassen (1) eine Genotypisierungsassay für Speziation Inseln 10-12, (2) eine Genotypisierungsassay Anerkennung nicht gleichbedeutend SNPs in der 1014 th Aminosäurecodon Position para-Gen (der Knock-down-Widerstand oder kdr, SNP) 13 -18, (3) Parasitenerkennung PCR 19-23, und (4) Screening von wirtsspezifischen DNA in Moskito midguts 24,25.
Wir entwickelten eine Mehrnachweisassay (MDA), die alle diese Assays in einer einzigen Multiplex-Reaktion mit dem Ziel, eine Kombinationalyzing epidemiologisch wichtige Eigenschaften der Malariavektoren in Afrika. Die MDA-Assay umfasst mehrere Marker zum Detektieren (1) Art (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii oder andere (keiner der drei)), (2), Insektizidresistenz in kdr SNPs dargestellt (beide L1014F und L1014S) , (3) auf zwei wesentliche Malaria-Parasiten, Plasmodium falciparum und P. vivax, und (4) Blutquelle von einem aviären und sechs Säugetierwirten.
Traditionell wurden diese Assays in separaten Polymerase-Kettenreaktion durchgeführt. Wenn all diese Tests werden unter Verwendung einer herkömmlichen PCR-Plattform erfolgt, bedarf es der Durchführung 8-10 PCR-Assays und Begleit Gelelektrophorese Schritte. Jeder einzelne PCR-Reaktion von der Vorbereitung bis Dokumentation der Ergebnisse dauert 4-5 Stunden, während der hier vorgestellten MDA Verfahren dauert etwa 5 Stunden in der Gesamtheit. Dies entspricht einer 90% Einsparungen bei den Arbeitskosten allein. Der MDA präsentiert hier kostet $ 5pro Probe, um alle 33 SNPs Genotyp. Dies ist erheblich weniger teuer als die einzigen Agarosegel basierenden Assays, die ungefähr $ 1,50 pro Probe kostet. Assays Erkennen alle Merkmale durch die MDA abgedeckt würde ein Minimum von 8-10 verschiedenen Agarose-Gel-basierte Assays zu einem Preis von $ 15.12 pro Probe erforderlich. Darüber hinaus ist die MDA stark die Möglichkeit der Erzeugung eines falschen positiven oder negativen durch die Verwendung von mindestens drei Marker für jeden Parasiten oder Host Quellenerkennung reduziert.
Die Plattform verwendeten wir nicht an Malaria Vektoren beschränkt, sondern kann in einer Vielzahl von Anwendungen, wie der Medizin, Veterinärmedizin, und grundlegende Biologie 26-28 verwendet werden. Vertiefte Assoziationsstudien oder Populationsgenetik Studien mit einer großen (in der Reihenfolge der 100s) Anzahl der Proben erfordern kosteneffiziente Tests Screening für mehrere Marker gleichzeitig. Die meisten Studien, die zwei oder mehr getrennten PCR-Assays konnte MDA für schnellere Ergebnisse zu geringeren Kosten zu realisieren. </p>
– Flugzeit (MALDI-TOF) -Massenspektrometrie 33-37 PCR-Amplifikation shrimp alkalischer Phosphatase (SAP) Reaktion SNP Verlängerung Verlängerungsprodukt Anlage und Matrix-unterstützte Laser-Desorption / Ionisation: Das MDA ist aus fünf Hauptschritten zusammengesetzt. Die erste PCR-Amplifikation Schritt verstärkt DNA flankieren jedes SNP damit genügend Template-DNA wird an der SNP Verlängerungsschritt verfügbar. Der SAP-Reaktion neutralisiert ungenutzte dNTPs, die mit der folgenden SNP Verlängerungssch…
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Drs. Anthony Cornel und Laura Norris an der UC Davis und Dr. Katharina Kreppel an der Universität von Glasgow für die Bereitstellung von Moskito Proben aus Tansania. Wir danken Frau Smita Das und Dr. Douglas Norris von der Johns Hopkins School of Public Health für den Austausch von Moskito Proben aus Sambia. Wir danken auch Mr. Lee V. Millon an der Tierärztlichen Genetics Laboratory für das Training auf Assay-Design. Diese Arbeit wurde durch das National Institute of Health gewähren R01AI 078.183 und R21AI062929.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids. |
MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP |
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set | Sequenom | 10158 | Reagents used for iPLEX assay including SAP kit. |