Malaria transmitting mosquitoes have a number of epidemiologically important characteristics that can only be detected using molecular techniques. Utilizing a MALDI-TOF based SNP genotyping platform, we developed an assay for simultaneously detecting multiple key traits (species, insecticide resistance, parasite infection and host choice) of malaria vectors.
El complejo de especies de Anopheles gambiae incluye el principal transmisores de la malaria mosquitos en África. Debido a que estas especies son de tal importancia médica, varios rasgos se caracterizan típicamente utilizando ensayos moleculares para ayudar en los estudios epidemiológicos. Estos rasgos incluyen la identificación de especies, resistencia a los insecticidas, el estado de infección del parásito, y la preferencia de acogida. Dado que las poblaciones del complejo Anopheles gambiae son morfológicamente indistinguibles, una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se utiliza tradicionalmente para identificar las especies. Una vez que se conoce la especie, varios ensayos posteriores se realizan rutinariamente Para aclarar aún más características. Por ejemplo, mutaciones conocidas como KDR en un gen párrafo confieren resistencia contra el DDT y los insecticidas piretroides. Además, los ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) o ensayos de PCR de detección de ADN del parásito Plasmodium se utilizan para detectar parásitos presentes en los tejidos de mosquitos. Por último, una combinación de PCR y digestiones con enzimas de restricción se puede utilizar para dilucidar preferencia host (por ejemplo, humano frente a sangre animal) mediante el cribado de la harina de sangre de mosquitos para el ADN-host específico. Hemos desarrollado un ensayo de detección múltiple (MDA) que combina todos los ensayos mencionados anteriormente en un único 33SNPs de genotipado multiplex de reacción durante 96 o 384 muestras a la vez. Debido a que la MDA incluye múltiples marcadores para las especies, detección de Plasmodium, y la identificación de sangre anfitrión, la probabilidad de generar falsos positivos o negativos se reduce en gran medida a partir de ensayos anteriores que incluyen sólo un marcador por rasgo. Este ensayo robusto y simple puede detectar estos rasgos clave de mosquitos de manera rentable y en una fracción del tiempo de los ensayos existentes.
Anopheles arabiensis, Anopheles coluzzii y Anopheles gambiae son los principales vectores responsables de la transmisión de la malaria en África 1. Estas tres especies son morfológicamente indistinguibles 2 y sólo se pueden distinguir por ensayos moleculares 3-9. Además, hay muchos ensayos posteriores realizados rutinariamente para ayudar a los estudios epidemiológicos y de genética de población. Estos incluyen (1) un ensayo de genotipado para las islas de especiación 10-12, (2) un ensayo de genotipado reconocimiento no es sinónimo SNPs en el 1014 ª posición del aminoácido codón del gen para (la resistencia knock-down, o kdr, SNP) 13 -18, (3) la detección de parásitos PCR 19-23, y (4) la detección de ADN-host específico en midguts de mosquitos 24,25.
Hemos desarrollado un ensayo de detección múltiple (MDA) que combina todos estos ensayos en una reacción multiplex individual con el objetivo de unaalyzing características epidemiológicamente importantes de vectores de la malaria en África. El ensayo MDA incluye múltiples marcadores para la detección de (1) especies (A. arabiensis, A. gambiae, A. coluzzii, u otro (ninguno de los tres)), (2) resistencia a los insecticidas representado en kdr SNPs (tanto L1014F y L1014S) , (3) la presencia de dos importantes parásitos de la malaria, Plasmodium falciparum y P. vivax, y (4) fuente de sangre de uno aviar y seis huéspedes mamíferos.
Tradicionalmente, estos ensayos se llevaron a cabo en reacciones en cadena de la polimerasa por separado. Cuando todos estos ensayos se realizaron utilizando una plataforma PCR convencional, se requiere la realización de 8-10 ensayos de reacción de PCR y acompañar los pasos de electroforesis en gel. Cada reacción individual PCR desde la preparación hasta que documentan los resultados toma 4-5 horas, mientras que el método de MDA se presenta aquí toma aproximadamente 5 horas en su totalidad. Esto es equivalente a un 90% de ahorro en costos de mano de obra solamente. La MDA presentó aquí cuesta $ 5por muestra para determinar el genotipo de los 33 SNPs. Esto es considerablemente menos costoso que los ensayos individuales basados en gel de agarosa, que cuesta alrededor de $ 1.50 por muestra. Los ensayos que detectan todas las características cubiertas por la MDA requeriría un mínimo de 8-10 ensayos basados en gel de agarosa separadas por un costo de $ 15.12 por cada muestra. Además, la MDA reduce enormemente la posibilidad de generar un falso positivo o negativo mediante la utilización de al menos tres marcadores para cada parásito o fuente de acogida de detección.
La plataforma se utilizó no se limita a vectores de la malaria, pero se puede utilizar en una amplia variedad de aplicaciones tales como la medicina, medicina veterinaria, y la biología básica 26-28. Estudios en profundidad de asociación o de genética de poblaciones estudios con un gran número (con el fin de 100s) de muestras requieren ensayos de cribado rentables para varios marcadores simultáneamente. La mayoría de los estudios que utilizan dos o más ensayos de PCR separadas podrían implementar el MDA para resultados más rápidos a un costo menor. </p>
La MDA se compone de cinco pasos principales: la amplificación por PCR, la fosfatasa alcalina de gamba (SAP) de reacción, de extensión SNP, producto de extensión de acondicionamiento, y la matriz con ayuda de láser desorción / ionización – tiempo de vuelo (MALDI-TOF) 33-37. La primera etapa de amplificación PCR amplifica ADN que flanquea cada SNP de manera que la plantilla de ADN lo suficientemente estará disponible en la etapa de extensión de SNP. La reacción SAP neutraliza dNTPs no utilizados que…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a los Dres. Anthony Cornel y Laura Norris en la UC Davis y el Dr. Katharina Kreppel en la Universidad de Glasgow para proporcionar muestras de mosquitos de Tanzania. Damos las gracias a la Sra Smita Das y el Dr. Douglas Norris de la Escuela Johns Hopkins de Salud Pública para el intercambio de muestras de mosquitos de Zambia. También damos las gracias al Sr. Lee V. Millon en el Laboratorio de Genética Veterinaria para la formación en diseño de ensayo. Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud de subvención R01AI 078.183 y R21AI062929.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
MassARRAY Analyzer Compact | Sequenom | MT9 | MALDI-TOF mass spectrometry for genomic applications to analyze nucleic acids. |
MassARRAY Nanodispenser | Sequenom | RS1000 | Transfers completed iPLEX reaction products to the SpectroCHIP |
iPLEX Gold Genotyping Reagent Set | Sequenom | 10158 | Reagents used for iPLEX assay including SAP kit. |