Generatie van de CAR T-cellen voor adoptieve Therapie in de context van glioblastoma Standard of Care
Summary
The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.
Abstract
Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.
Introduction
Glioblastoom (GBM) is de meest voorkomende primaire kwaadaardige hersentumor en is altijd fataal. Chirurgische resectie gekoppeld aan aspecifieke zorgstandaard chemotherapie en radiotherapie niet volledig te elimineren kwaadaardige cellen, resulterend in een sombere prognose van minder dan 15 maanden bij patiënten met deze ziekte 1. Daarentegen immunotherapie biedt een nauwkeurige benadering specifiek richten op tumorcellen, en heeft dus de potentie om te dienen als een zeer effectieve behandeling platform met verminderd risico van toxiciteit zekerheden 2-4. T-cellen ontwikkeld ex vivo te uiten chimeer antigen receptoren (auto's) bieden een veelzijdige strategie voor tumor immunotherapie. Auto's worden gegenereerd door het fuseren van het extracellulaire variabele gebied van een antilichaam met één of meer intracellulaire T-cel signalerende moleculen (s), in plaats van een full-length major histocompatibility complex (MHC) -beperkte T-cel receptor 5. Deze wijze van antilichaam-achtige antigeen erkennOp maakt reactieve antigen-specifieke T-cellen te herkennen en tumorantigenen in afwezigheid van MHC en kan worden aangepast voor een virtueel oneindig antigeen repertoire.
CAR T-cellen gemanipuleerd tegen diverse tumor antigenen aangetoond preklinische werkzaamheid en uitstekende belofte in de kliniek 6-9. Met name in de context van GBM, auto T cel targeting epidermale groeifactorreceptor variant III (EGFRvIII), een tumor-specifieke mutatie expressie op het celoppervlak 10, bleek de overleving verlengen-glioom dragende muizen 11. Ondanks hun veelzijdigheid, maar de klinische voordelen van CAR adoptieve therapie is nog niet volledig gerealiseerd, mede als gevolg van tumor-geassocieerde immunosuppressie en het immuunsysteem belastingontduiking 12-16 evenals uitdagingen bij het opzetten en onderhouden van antigeen-specifieke T-cellen in vivo. Gebruik te maken van standaard van zorg (SOC) met immunotherapie kan mogelijk overwinnen een aantal van deze limitaties, resulterend in verhoogde werkzaamheid in zowel de preklinische en klinische setting.
SOC voor post-resectie GBM bestaat uit een hoge dosis temozolomide (TMZ), een DNA-alkylerende stof 17, en het hele brein bestraling (WBI) 1. Deze behandelingen worden geacht om synergie met tumor vaccins via opregulatie van tumor MHC expressie 18-20 en het loskomen van antigenen door dode tumorcellen 17,19,21,22. Inderdaad, de toevoeging van TMZ 20,23 of 18,24 WBI leidt tot verhoogde antitumorale werkzaamheid van immuun gebaseerde behandelingen in de preklinische omgeving. Bovendien, net als vele niet-specifieke cytotoxische chemotherapeutica, TMZ bekend systemische lymfopenie 25,26, die kan worden benut als middel gastheer-conditioning voor adoptieve therapie platforms 27-29 veroorzaken. TMZ-gemedieerde lymphodepletion is aangetoond dat de frequentie en de functie van de antigeen-specifieke T-cellen verbeteren, wat leidt tot verhoogde werkzaamheid van een Adoptieve therapie platform tegen intracraniële tumoren 30. In de context van CAR therapie lymphodepletion fungeert als middel gastheer-conditioning zowel vermindering van het aantal endogene suppressor-T-cellen 31 en induceren homeostatische proliferatie 32 via verminderde concurrentie voor cytokinen 33, waardoor antitumoractiviteit 11,34 verbeteren. Gezien de synergetische relatie tussen GBM SOC en immunotherapie platforms evalueren adoptieve nieuwe therapieën en vaccins platforms in de context van SOC is essentieel voor het trekken van zinvolle conclusies inzake werkzaamheid.
In dit protocol beschrijven we een werkwijze voor het genereren en intraveneuze toediening van muizen EGFRvIII specifieke CAR T-cellen naast TMZ en WBI in muizen met EGFRvIII-positieve intracraniale tumoren (zie Figuur 1 voor de behandeling tijdlijn). In het kort worden AUTO T-cellen gemaakt door retrovirale transductie. Menselijke embryonale nier (HEK) 293T cellen worden getransfecteerd met een DNA / lipide-complex (met de CAR vector en PCL-Eco plasmiden) virus, die vervolgens wordt gebruikt om geactiveerde muriene splenocyten die zijn geoogst en gekweekt in parallel transduceren produceren. Tijdens CAR generatie, zijn murine gastheren dragen EGFRvIII-positieve intracraniale tumoren toegediend gefractioneerde hele brein röntgenbestraling en systemische TMZ behandeling bij doses vergelijkbaar klinische SOC. AUTO T-cellen worden vervolgens intraveneus te lymphodepleted gastheren geleverd.
De volgende procedure wordt beschreven in zeven afzonderlijke fasen: (1) Toediening van temozolomide tumordragende muizen, (2) Whole Brain Bestraling van tumordragende muizen, (3) transfectie (4) Splenectomie en T cel bereiding, (5 ) Transduction, (6) AUTO T-cel Cultuur en Harvest, en (7) AUTO T-cel toediening aan muizen met een tumor. Deze fasen bestaan uit verschillende stappen die 6-7 dagen bestrijken en tegelijkertijd worden uitgevoerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
De behandeling tijdlijn hier beschreven is ontworpen voor het modelleren klinische kwaliteit van de zorg en het benutten ervan bij de CAR adoptieve therapie. CAR T cel doses TMZ regimes en radiotherapie toediening kan worden gemodificeerd ter verbetering van in vivo T-cel activiteit lymphodepletion en tumor doden. TMZ regimes kan worden verhoogd tot gastheer myeloablatie en verhoogde expansie van adoptief overgedragen cellen 30 verkregen. Bovendien kan de lymphodepletive effecten van TMZ worden geïn…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Laura Johnson and Dr. Richard Morgan for providing the CAR retroviral construct. The authors also thank Giao Ngyuen for her assistance with dosimetry for whole brain irradiation. This work was supported by an NIH NCI grant 1R01CA177476-01.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector | Imgenex | 10045P | Helper vector for generating CAR retrovirus |
| Concanavalin A | Sigma Aldrich | C2010 | Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction |
| Retronectin | ClonTech/Takara | T100B | Facilitates retroviral transduction of T cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Transfection reagent |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life technologies | 11995-065 | HEK293 culture media |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | T cell culture media |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life technologies | 11058-021 | Transfection media |
| 200 mM L-Glutamine | Life technologies | 25030-081 | T cell culture media supplement |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Life technologies | 11360-070 | T cell culture media supplement |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life technologies | 11140-050 | T cell culture media supplement |
| 55 mM 2-Mercaptoethanol | Life technologies | 21985-023 | Reducing agent to remove free radicals |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies | 15140-122 | T cell culture media supplement |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Life technologies | 15750-060 | T cell culture media supplement |
| GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100-500 | Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Standard Grade | Gemini Bio Products | 700-100P | Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates |
| Pharm Lyse (10X concentrate) | BD Biosciences | 555899 | Lyses red blood cells during splenocyte processing |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Corning | 352350 | Filters away large tissue particles during splenocyte processing |
| 100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine | Corning | 356469 | Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection |
| Temozolomide | Best Pharmatech | N/A | Lyophilized powder prepared on the day of administration |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Life Sciences | D2650 | Necessary for complete dissolution of temozolomide |
| Saline | Hospira | IM 0132 (5/04) | Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine |
| Ketathesia HCl | Henry Schein Animal Health | 11695-0701-1 | Ketamine solution |
| AnaSed | Lloyd Inc | N/A | Xylazine sterile solution 100 mg/mL |
References
- Stupp, R., et al. Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma. N Engl J Med. 352 (10), 987-996 (2005).
- Kantoff, P., Higano, C., Shore, N., Berger, E., Small, E. Sipuleucel-T immunotherapy for castration-resistant prostate cancer. N Engl J Med. (363), 411-422 (2010).
- Hodi, F. S., et al. Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. 363 (8), 711-723 (2010).
- Schwartzentruber, D. J., et al. gp100 peptide vaccine and interleukin-2 in patients with advanced melanoma. N Engl J Med. 364 (22), 2119-2127 (2011).
- Gross, G., Gorochov, G., Waks, T., Eshhar, Z. Generation of effector T cells expressing chimeric T cell receptor with antibody type-specificity. Transplant Proc. 21 (1 Pt 1), 127-130 (1989).
- Pule, M. A., et al. Virus-specific T cells engineered to coexpress tumor-specific receptors: persistence and antitumor activity in individuals with neuroblastoma. Nat Med. 14 (11), 1264-1270 (2008).
- Kochenderfer, J. N., et al. B-cell depletion and remissions of malignancy along with cytokine-associated toxicity in a clinical trial of anti-CD19 chimeric-antigen-receptor-transduced T cells. Blood. 119 (12), 2709-2720 (2012).
- Porter, D. L., Levine, B. L., Kalos, M., Bagg, A., June, C. H. Chimeric antigen receptor-modified T cells in chronic lymphoid leukemia. N Engl J Med. 365 (8), 725-733 (2011).
- Brentjens, R. J., et al. Safety and persistence of adoptively transferred autologous CD19-targeted T cells in patients with relapsed or chemotherapy refractory B-cell leukemias. Blood. 118 (18), 4817-4828 (2011).
- Wikstrand, C. J., et al. Monoclonal antibodies against EGFRvIII are tumor specific and react with breast and lung carcinomas and malignant gliomas. Cancer Res. 55 (14), 3140-3148 (1995).
- Sampson, J. H., et al. EGFRvIII mCAR-modified T-cell therapy cures mice with established intracerebral glioma and generates host immunity against tumor-antigen loss. Clin Cancer Res. 20 (4), 972-984 (2014).
- Kuppner, M. C., Hamou, M. F., Sawamura, Y., Bodmer, S., de Tribolet, N. Inhibition of lymphocyte function by glioblastoma-derived transforming growth factor beta 2. J Neurosurg. 71 (2), 211-217 (1989).
- Wintterle, S., et al. Expression of the B7-related molecule B7-H1 by glioma cells: a potential mechanism of immune paralysis. Cancer Res. 63 (21), 7462-7467 (2003).
- Fecci, P. E., et al. Increased regulatory T-cell fraction amidst a diminished CD4 compartment explains cellular immune defects in patients with malignant glioma. Cancer Res. 66 (6), 3294-3302 (2006).
- Wilmotte, R., et al. B7-homolog 1 expression by human glioma: a new mechanism of immune evasion. Neuroreport. 16 (10), 1081-1085 (2005).
- Yang, B. C., et al. Mediation of enhanced transcription of the IL-10 gene in T cells, upon contact with human glioma cells, by fas signaling through a protein kinase A-independent pathway. Journal of Immunology. 171 (8), 3947-3954 (2003).
- Reilly, S. M., et al. Temozolomide: a new oral cytotoxic chemotherapeutic agent with promising activity against primary brain tumours. Eur J Cancer. 29A (7), 940-942 (1993).
- Newcomb, E., et al. The Combination of Ionizing Radiation and Peripheral Vaccination Produces Long-term Survival of Mice Bearing Established Invasive GL261Gliomas. Clin Cancer Res. 12, 4730-4737 (2006).
- Park, B., Yee, C., Lee, K. M. The effect of radiation on the immune response to cancers. Int J Mol Sci. 15 (1), 927-943 (2014).
- Fritzell, S., et al. Intratumoral temozolomide synergizes with immunotherapy in a T cell-dependent fashion. Cancer Immunol Immunother. 62 (9), 1463-1474 (2013).
- Park, S. D., et al. Cross-priming by temozolomide enhances antitumor immunity of dendritic cell vaccination in murine brain tumor model. Vaccine. 25 (17), 3485-3491 (2007).
- Emens, L. A., Jaffee, E. M. Leveraging the activity of tumor vaccines with cytotoxic chemotherapy. Cancer Res. 65 (18), 8059-8064 (2005).
- Murphy, K. A., et al. An in vivo immunotherapy screen of costimulatory molecules identifies Fc-OX40L as a potent reagent for the treatment of established murine gliomas. Clin Cancer Res. 18 (17), 4657-4668 (2012).
- Newcomb, E. W., et al. Radiotherapy enhances antitumor effect of anti-CD137 therapy in a mouse Glioma model. Radiat Res. 173 (4), 426-432 (2010).
- Su, Y. B., Krown, S. E., Livingston, P. O., Wolchok, J. D., Chapman, P. B. How lymphotoxic is dose-intensified temozolomide? The glioblastoma experience. J Clin Oncol. 23 (18), 4235-4236 (2005).
- Neyns, B., Tosoni, A., Hwu, W. J., Reardon, D. A. Dose-dense temozolomide regimens: antitumor activity, toxicity, and immunomodulatory effects. Cancer. 116 (12), 2868-2877 (2010).
- Muranski, P., et al. Increased intensity lymphodepletion and adoptive immunotherapy-how far can we go. Nat Clin Pract Oncol. 3 (12), 668-681 (2007).
- Wrzesinski, C., Restifo, N. P. Less is more: lymphodepletion followed by hematopoietic stem cell transplant augments adoptive T-cell-based anti-tumor immunotherapy. Current Opinion in Immunology. 17 (2), 195-201 (2005).
- Dudley, M. E., et al. Adoptive cell therapy for patients with metastatic melanoma: evaluation of intensive myeloablative chemoradiation preparative regimens. J Clin Oncol. 26 (32), 5233-5239 (2008).
- Sanchez-Perez, L. A., et al. Myeloablative Temozolomide Enhances CD8(+) T-Cell Responses to Vaccine and Is Required for Efficacy against Brain Tumors in Mice. Plos One. 8 (3), (2013).
- Su, Y. B., et al. Selective CD4+ lymphopenia in melanoma patients treated with temozolomide: a toxicity with therapeutic implications. J Clin Oncol. 22 (4), 610-616 (1200).
- Dummer, W., et al. T cell homeostatic proliferation elicits effective antitumor autoimmunity. J Clin Invest. 110 (2), 185-192 (2002).
- Gattinoni, L., et al. Removal of homeostatic cytokine sinks by lymphodepletion enhances the efficacy of adoptively transferred tumor-specific CD8+ T cells. J Exp Med. 202 (7), 907-912 (2005).
- Wrzesinski, C., et al. Increased intensity lymphodepletion enhances tumor treatment efficacy of adoptively transferred tumor-specific T cells. J Immunother. 33 (1), 1-7 (2010).
- Hughes, M. S., et al. Transfer of a TCR gene derived from a patient with a marked antitumor response conveys highly active T-cell effector functions. Hum Gene Ther. 16 (4), 457-472 (2005).
- Morgan, R. A., et al. Recognition of glioma stem cells by genetically modified T cells targeting EGFRvIII and development of adoptive cell therapy for glioma. Hum Gene Ther. 23 (10), 1043-1053 (2012).
- Kerkar, S. P., et al. Genetic engineering of murine CD8+ and CD4+ T cells for preclinical adoptive immunotherapy studies. J Immunother. 34 (4), 343-352 (2011).
