Geração de células T para CAR adoptivo Therapy no Contexto do Glioblastoma Padrão de Atendimento
Summary
The lymphodepletive and immunomodulatory effects of chemotherapy and radiation standard of care can be leveraged to enhance the antitumor efficacy of T cell immunotherapy. We outline a method for generating EGFRvIII-specific chimeric antigen receptor (CAR) T cells and administering them in the context of glioblastoma standard of care.
Abstract
Adoptive T cell immunotherapy offers a promising strategy for specifically targeting and eliminating malignant gliomas. T cells can be engineered ex vivo to express chimeric antigen receptors specific for glioma antigens (CAR T cells). The expansion and function of adoptively transferred CAR T cells can be potentiated by the lymphodepletive and tumoricidal effects of standard of care chemotherapy and radiotherapy. We describe a method for generating CAR T cells targeting EGFRvIII, a glioma-specific antigen, and evaluating their efficacy when combined with a murine model of glioblastoma standard of care. T cells are engineered by transduction with a retroviral vector containing the anti-EGFRvIII CAR gene. Tumor-bearing animals are subjected to host conditioning by a course of temozolomide and whole brain irradiation at dose regimens designed to model clinical standard of care. CAR T cells are then delivered intravenously to primed hosts. This method can be used to evaluate the antitumor efficacy of CAR T cells in the context of standard of care.
Introduction
Glioblastoma (GBM) é o tumor cerebral maligno primário mais comum e é invariavelmente fatal. A ressecção cirúrgica associada com o padrão não específico de quimioterapia e radioterapia cuidado para não eliminar completamente as células malignas, resultando em um mau prognóstico de menos de 15 meses, em pacientes com esta doença 1. Em contraste, a imunoterapia oferece uma abordagem precisa para visar especificamente células tumorais, e portanto tem o potencial de servir como uma plataforma de tratamento altamente eficaz, com um risco reduzido de toxicidade colateral 2-4. As células T engenharia ex vivo para expressar receptores de antigénios quiméricos (CARs) oferecem uma estratégia versátil para imunoterapia de tumor. CARs são gerados por fusão da região variável extracelular de um anticorpo com uma ou mais das células T intracelular molécula (s) de sinalização, em vez de um de histocompatibilidade principal de comprimento completo complexo (MHC) -restricted receptor de células T 5. Este modo de anticorpo-like reconhecimen antígenosobre permite células específicas para o antigénio T reactivas para reconhecer e responder aos antigénios tumorais na ausência de MHC e podem ser adaptados para um repertório antigénio praticamente infinito.
CARRO células T modificadas contra uma variedade de antigénios de tumor demonstraram eficácia pré-clínica e excelente na promessa clínica 6-9. Especificamente, no contexto de GBM, uma variante de t CARRO plataforma de direccionamento celular de crescimento epidermal do receptor do factor III (EGFRvIII), uma mutação específica do tumor expressos na superfície da célula 10, foi mostrado prolongar a sobrevivência de ratinhos portadores de glioma 11. Apesar de sua versatilidade, no entanto, o benefício clínico da terapia adoptiva CAR ainda não foi plenamente realizado, em parte devido à imunossupressão associada ao tumor e evasão imune 12-16, bem como desafios na criação e manutenção de células T específicas de antigénio in vivo. Aproveitando padrão de atendimento (SOC) com a imunoterapia pode potencialmente superar vários destes limitações, resultando num aumento da eficácia tanto na configuração de pré-clínica e clínica.
SOC para pós-ressecção GBM consiste de temozolomida em altas doses (TMZ), um agente de alquilação de ADN 17, e a irradiação do cérebro inteiro (WBI) 1. Presume-se que estes tratamentos a sinergia com vacinas tumorais via regulação positiva de tumor MHC expressão 18-20 eo derramamento de antígenos pelas células tumorais mortas 17,19,21,22. Com efeito, a adição de TMZ 20,23 ou 18,24 WBI leva ao aumento da eficácia antitumoral de tratamentos de base imunológica na configuração pré-clínico. Além disso, como muitos quimioterápicos citotóxicos não específicos, TMZ é conhecido por causar 25,26 lymphopenia sistêmica, que pode ser aproveitado como um meio de host-condicionado para as plataformas de terapia adotivos 27-29. Lymphodepletion TMZ mediada tem demonstrado aumentar a frequência e função de células T específicas de antigénio, que conduz a um aumento da eficácia de um adopplataforma terapia tiva contra tumores intracranianos 30. No contexto da terapia de CAR, lymphodepletion serve como um meio de acolhimento-condicionado tanto pela redução do número de células T supressoras endógenas 31, e induzindo a proliferação homeostática 32 através de competição reduzida para citocinas 33, aumentando assim a actividade anti-tumoral 11,34. Dada a relação sinérgica entre SOC e imunoterapia plataformas GBM, avaliando terapias adotivos novos e plataformas de vacina no contexto do SOC é fundamental para tirar conclusões significativas a respeito da eficácia.
Neste protocolo, que descrevem um método para a geração e administração intravenosa de células de murino CAR T específicas para EGFRvIII ao lado TMZ e WBI em camundongos com tumores intracranianos EGFRvIII-positivos (veja a Figura 1 para a linha do tempo de tratamento). Resumidamente, as células T são feitos CAR ex vivo por transdução retroviral. Rim embrionário humano (HEK) 293T células são transfectadas utilizando um complexo de ADN / lípido (contendo o vector CAR e plasmídeos pCL-Eco) para produzir vírus, que é então utilizado para transduzir os esplenócitos de murideo activadas que são colhidas e cultivadas em paralelo. Durante o curso da geração CAR, hospedeiros murinos com tumores intracranianos EGFRvIII-positivos são administrados fraccionado em todo o cérebro de irradiação de raios X e TMZ tratamento sistémico com doses comparáveis às SOC clínica. Células carro T são então entregues por via intravenosa aos anfitriões lymphodepleted.
O procedimento que se segue é descrita em sete fases distintas: (1) administração de temozolomida para (3) Transfecção Ratos, (2) Irradiação Cérebro Total de Ratos portadores de tumor, que possui o tumor, (4) e esplenectomia Preparação de células T, (5 ) Transdução, (6) Cultura de células T CAR e colheita, e (7) a administração de células T CAR para portadores de tumor Ratos. Estas fases consistem em várias etapas que se estendem por 6-7 dias e são realizadas simultaneamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
A linha do tempo de tratamento descrito aqui foi projetado para modelar padrão clínico de cuidado e alavancar os seus efeitos para a terapia adotiva CAR. T doses carro de célula, regimes TMZ, administrativos e radioterapia podem ser modificados para aumentar a actividade in vivo de células T, lymphodepletion e assassinato tumor. Os regimes de TMZ pode ser aumentada para se obter mieloablação hospedeiro e aumentar a expansão das células adoptivamente transferidos 30. Além disso, os efeitos ly…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Dr. Laura Johnson and Dr. Richard Morgan for providing the CAR retroviral construct. The authors also thank Giao Ngyuen for her assistance with dosimetry for whole brain irradiation. This work was supported by an NIH NCI grant 1R01CA177476-01.
Materials
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| pCL-Eco Retrovirus Packaging Vector | Imgenex | 10045P | Helper vector for generating CAR retrovirus |
| Concanavalin A | Sigma Aldrich | C2010 | Non-specific mitogen to induce T cell proliferation and viral transduction |
| Retronectin | ClonTech/Takara | T100B | Facilitates retroviral transduction of T cells |
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Transfection reagent |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Life technologies | 11995-065 | HEK293 culture media |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | T cell culture media |
| Opti-MEM I Reduced Serum Medium | Life technologies | 11058-021 | Transfection media |
| 200 mM L-Glutamine | Life technologies | 25030-081 | T cell culture media supplement |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Life technologies | 11360-070 | T cell culture media supplement |
| 100X MEM Non-Essential Amino Acids Solution | Life technologies | 11140-050 | T cell culture media supplement |
| 55 mM 2-Mercaptoethanol | Life technologies | 21985-023 | Reducing agent to remove free radicals |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life technologies | 15140-122 | T cell culture media supplement |
| Gentamicin (50 mg/mL) | Life technologies | 15750-060 | T cell culture media supplement |
| GemCell U.S. Origin Fetal Bovine Serum | Gemini Bio Products | 100-500 | Provides growth factors and nutrients for in vitro cell growth |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Standard Grade | Gemini Bio Products | 700-100P | Blocks non-specific binding of retrovirus to retronectin-coated plates |
| Pharm Lyse (10X concentrate) | BD Biosciences | 555899 | Lyses red blood cells during splenocyte processing |
| 70 µm Sterile Cell Strainers | Corning | 352350 | Filters away large tissue particles during splenocyte processing |
| 100 mm BioCoat Culture Dishes with Poly-D-Lysine | Corning | 356469 | Promotes HEK293 cell adhesion to maximize proliferation after transfection |
| Temozolomide | Best Pharmatech | N/A | Lyophilized powder prepared on the day of administration |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma Life Sciences | D2650 | Necessary for complete dissolution of temozolomide |
| Saline | Hospira | IM 0132 (5/04) | Solvent for temozolomide and ketamine/xylazine |
| Ketathesia HCl | Henry Schein Animal Health | 11695-0701-1 | Ketamine solution |
| AnaSed | Lloyd Inc | N/A | Xylazine sterile solution 100 mg/mL |
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