Abstract
Cryptococcosis er en livstruende infektion forårsaget af patogene svampe af slægten Cryptococcus. Infektion sker ved inhalation af sporer, som er i stand til at replikere i den dybe lunge. Fagocytose af Cryptococcus af makrofager er en af de måder, sygdommen er i stand til at sprede sig i centralnervesystemet at forårsage dødelig meningoencephalitis. Derfor undersøgelse af sammenhængen mellem Cryptococcus og makrofager er vigtigt at forstå udviklingen af infektionen. Nærværende undersøgelse beskriver en trin-for-trin-protokol til at studere makrofag infektivitet ved C. neoformans in vitro. Ved hjælp af denne protokol, er den rolle, værten steroler på vært-patogen interaktioner undersøgt. Forskellige koncentrationer af methyl - cyclodextrin (MCD) blev anvendt til at udtømme cholesterol fra murine reticulum sarkom makrofag-lignende cellelinje J774A.1. Kolesterol udtømning blev bekræftet og kvantificeret ved hjælp af både en kommercielt tilrådighede kolesterol kvantificering kit og tyndtlagskromatografi. Kolesterol udtømte celler blev aktiveret med Lipopolysacharide (LPS) og interferon gamma (IFNy) og inficeret med antistof-opsoniseret Cryptococcus neoformans vildtype H99-celler ved et effektor-til-mål-forhold på 1: 1. Inficerede celler blev overvåget efter 2 timers inkubation med C. neoformans og deres fagocytiske indeks blev beregnet. Kolesterol udtynding resulterede i en signifikant reduktion i den fagocytiske indeks. De præsenterede protokoller giver en bekvem metode til at efterligne indledningen af infektion proces i et laboratoriemiljø og undersøge den rolle vært lipidsammensætning på infektivitet.
Introduction
Fagocytose er en proces, hvorved ekstracellulære enheder internaliseres af værtsceller. Det er et centralt våben i immunsystemet arsenal til at forsvare mod patogener, men processen kan ofte undergraves af patogener for at muliggøre internalisering og breder sig i hele legemet 1. Fagocytose medieres af flere signalering begivenheder, der resulterer i binding og engulfment via omlejringer af værtscellens cytoskeleton. »Professionelle« fagocytter er i stand til at genkende og binde sig til opsoniner på overfladen af de invaderende patogen at signalere til fastgørelse og dannelsen af lamellipodia, der opsluger patogenet og danne en fagosomet 2. Blandt de såkaldte "professionelle" fagocytter er makrofager. Makrofager er højt specialiserede celler, der udfører beskyttende funktioner, der omfatter opsøge og fjerne smitstoffer, reparere beskadigede væv, og mediere inflammation, de fleste afdisse gennem processen med fagocytose 1,2.
Cryptococcus neoformans er en art af patogene gær, der forårsager en alvorlig sygdom, kendt som Cryptococcosis. Cryptococcus sporer indåndes af værten og resultere i en lungeinfektion, der er normalt asymptomatisk. Det menes, at eksponeringen er meget udbredt; en prøve af 61 børn fra Pediatric Infektionsmedicinsk Klinik på Bronx-Libanon Hospital Center konstateret, at alle de adspurgte havde antistoffer mod cryptococcal polysaccharid glucuronoxylomannan og andre undersøgelser har vist forekomst i både human immundefekt virus (HIV) inficerede og inficerede voksne 3, 4.. alveolære makrofager er den første linje i reaktion på lungeinfektion og i de fleste tilfælde med succes klar patogenet. Men i immunsvækkede personer (fx HIV og AIDS patienter) gæren er i stand til at overleve i makrofager. I dissetilfælde kan makrofager fungere som en niche for replikation af patogenet, og kan lette formidlingen til centralnervesystemet (CNS), hvor sygdommen bliver fatal 5-8. Det menes, at makrofager selv kan afgive gær direkte i hjernehinden, hjælper gæren til at krydse blod-hjerne-barrieren via "trojanske hest" model 3,9 - 11. Således er det vigtigt at forstå processen med fagocytose og de faktorer, der påvirker det, især i cryptococinfektioner.
Tidligere arbejde i andre patogen systemer peger på kolesterol og lipidklumper dannet af kolesterol som havende en vigtig rolle at spille i fagocytose 12-15. Kolesterol er den mest rigelige lipidtype i pattedyrsceller og består af 25 - 50% af den mammale celle membranen 16. Det har vist sig at spille en rolle i modulering BIOPhysical egenskaber membraner ved at ændre deres stivhed 17. Kolesterol og sphingolipider sammen danner lipid mikrodomæner i membranen kendt som lipidklumper. Lipidklumper har vist sig at være involveret i dannelsen af caveolae, samt give et isoleret domæne for visse typer signalering 16-18. På grund af deres lille størrelse, er det vanskeligt at studere lipidklumper in vivo. En nyttig måde til at studere rollen af lipidklumper er at ændre deres bestanddele. Methyl-β-cyclodextrin (MβCD) er en forbindelse, der har vist sig at udtømme kolesterol fra mammale membraner og er almindeligt anvendt til at undersøge rollen af lipidklumper 18.
I denne protokol, præsenterer vi en metode til at udtømme kolesterol fra værten cellemembraner og kvantificere virkningen af udtømningen på evnen af værtscellerne at fagocytere C. neoformans in vitro. Denne procedure gør brug af cellekultur Techniqdier på en udødeliggjort makrofaglignende cellelinie (J774A.1) som model for infektion. Kolesterol udtømning blev opnået ved udsættelse for MβCD, som har en hydrofob kerne specifikt til størrelsen af steroler og er i stand til at fungere som en vask for cholesterol at trække det ud af membranen 19. Kolesterol udtømning blev målt kvantitativt ved hjælp af et kommercielt tilgængeligt kit og kvalitativt ved hjælp af en modificeret Bligh-Dyer lipid ekstraktion efterfulgt af tyndtlagskromatografi (TLC) 20. . Fagocytose blev målt ved at inficere cellelinjen med en kultur af opsoniseret gær blandes med en cocktail af interferon-γ og lipopolysaccharid til aktivering af makrofager Cryptococcus blev opsoniseret anvendelse af en glucuronoxylomannan (GXM) antistof 21 - 23. Farvning og mikroskopi eksperimenter tilladt for visualisering af cellerne og beregning af fagocytiske indeks at vurdere graden af fagocytose. Tilsammen har dette protokol describes en grundlæggende metode, der integrerer ændringen af lipidsammensætning med en fysiologisk proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kolesterol Udtømning af J774A.1 Celler med MβCD
- I en steril biosikkerhed kabinet, frø 10 5 J774A.1 makrofag-lignende celler per brønd på en 96-brønds celledyrkningsplade i 200 pi Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (P / S). Der inkuberes ved 37 ° C og 5% CO 2 O / N.
- Fjern medier fra cellemonolaget, og vaskes cellerne to gange med 1x phosphatpufret saltvand (PBS), som er blevet filtreret eller autoklaveres.
- Tilsæt 200 pi MβCD opløsning i den ønskede koncentration (10 mM eller 30 mM i PBS) eller 1 x PBS som en kontrol og inkuberes i 30 minutter ved 37 ° C med omrystning. Fjern supernatanten og reserve ved stuetemperatur i kvantitativ analyse med kommercielt tilgængeligt kit umiddelbart efter proceduren.
- Vask cellerne to til tre gange med 1x PBS eller serumfrit DMEM og fortsætte med infektion eller lyserer celler ved pipetting to til tre gange med deioniseret H2O til analyse med tyndtlagskromatografi eller et kit.
BEMÆRK: Efter kolesterol udtømning kan anvendes et kommercielt tilgængeligt cholesterol kvantificering kit. Se stoffer, afsnit for detaljer. Følg producentens anvisninger, som skrevet.
2. Observation af cholesterolindholdet ved tyndtlagskromatografi (TLC)
- Vask en TLC tanken to gange med acetone og en gang med en opløsning af petroleumsether: diethylether: eddikesyre (65: 30: 1 efter volumen). Mættes tanken med petroleumsether: diethylether: eddikesyre (65: 30: 1 efter volumen) opløsning og lade O / N.
BEMÆRK: Organiske opløsningsmidler bør altid anvendes under en emhætte for at undgå indånding af dampe. Handsker og kittel, bør der på alle tidspunkter. Eddikesyre er en stærk syre og bør anvendes med forsigtighed. - I en steril biosikkerhed kabinet, frø 10 6 J774A.1 makrofag-lignende celler per brønd på en 6-brønds cell kultur pladen i et volumen på 5 ml varmt DMEM suppleret med 10% FBS og 1% P / S. Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
- Nedbryder makrofager af kolesterol ved at følge trin 1,2-1,4 substituere 1 ml til 200 pi givet fald at tage højde for den større godt størrelse.
- Der tilsættes 500 pi trypsin-EDTA til hver brønd, inkuberes i 3 minutter ved 37 ° C, og forsigtigt skrabe cellerne med en celleskraber.
- Overførsel til et mikrofugerør og tilføje yderligere 500 pi varm DMEM suppleret med 10% FBS og 1% P / S.
- Spin cellerne i 5 minutter ved 300 xg og fjern supernatanten.
- Tilføje en ekstra 500 pi varm DMEM suppleret med 10% FBS og 1% P / S til cellepelleten og resuspender forsigtigt ved pipettering op og ned.
- Fjern 10 pi celler og tælle cellerne på et hæmocytometer. Normalisere cellekoncentrationer fra hver prøve, og der tilsættes et lige antal celler til glasrør.
BEMÆRK: I dette trin kan manvælger at kombinere celler fra samme behandlingsgrupper for at opnå en mere koncentreret endelig lipidekstrakt. - Centrifuger cellerne ved 300 xg i 5 minutter ved stuetemperatur og fjerne medier.
- Der tilsættes 2 ml methanol og vortex. Derefter tilsættes 1 ml chloroform og vortex. Kontroller fase status for at sikre løsningen i monofasisk.
BEMÆRK: Rør kan opbevares ved 4 ° CO / N. - Centrifuger ved 1.700 xg i 10 minutter ved stuetemperatur og overføre supernatanten til et nyt rør
- Tilføj yderligere 1 ml chloroform efterfulgt af 1 ml dH 2 O. Vortex to gange i 30 sek. Centrifuger ved 1.700 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Et glasrør afvejes på en følsom balance og bruge et glas Pasteur pipette til at overføre den nedre fase i glasrøret med kendt vægt.
- Tør ned lipider i en centrifugalfordamper indtil tørre (ca. 2 timer). Rør afvejes med tørrede lipider og beregne den tørre lipid vægt.
BEMÆRK: Tørre lipider kan lagres i -20 ° C indtil den er klar til at udføre TLC. - Fortynd tørrede lipider i tilstrækkelig chloroform til at normalisere koncentrationen af lipid (normalt 20-50 pi) og belastning 20 pi af den fortyndede lipid på en silica-TLC-plade. Load 20 ug cholesterol fortyndet i 20 pi af chloroform som en standard.
- Tilføj tørret TLC-plade til den mættede TLC tank og tillade opløsningsmiddel at migrere op til 1 cm før plade kant. Fjern TLC-pladen fra tank og lad det tørre omkring 5 min.
- Visualiser lipider ved at placere i en jod akvarium damp til at kontrollere migration. Fjern og lad pletter at falme i ca 10 - 15 minutter under kølerhjelmen.
BEMÆRK: Jod er farligt ved indånding. Brug altid under en emhætte. - Fremstilles en opløsning for neutral lipid farvning ved at kombinere 60 ml methanol med 60 ml deioniseret H2O, 4 ml svovlsyre og 630 mg mangan chlorid.
- Forsigtigt og langsomt dyppe TLC-pladen i det neutrale lipid farveopløsning i en bakke og fjerne uden hamskifte fra silica lAyer.
BEMÆRK: neutral lipid farvning løsning kan genbruges flere gange, og det kan hentes fra bakken, og føres tilbage i en flaske til senere brug. - Lad pladen tørre under kølerhjelmen på RT, indtil alle bobler er forsvundet. Varm TLC-pladen på en varmeblok indstillet til 160 ° C og char til den ønskede farve.
BEMÆRK: En densitometri program som Vision Works LS kan anvendes til at kvantificere de forkullede bands at sammenligne lipid prøver.
3. Infektion af makrofager med C. neoformans (H99)
- I en steril biosikkerhed kabinet, frø 10 5 makrofag-lignende celler per brønd på en 96-brønds celledyrkningsplade i 200 pi DMEM suppleret med 10% FBS og 1% P / S. Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO 2, 5% CO 2 O / N.
BEMÆRK: Infektion kan også ske i glas bund konfokale retter til lettere billedbehandling; alle beløb forbliver de samme. - Dyrk en kultur af C. neoformans (H99)ved at inokulere 10 ml YNB med en koloni opnået fra en ramt plade og inkubering det O / N ved 30 ° C med omrystning.
- Vask og tælle C. neoformans (H99) celler.
- Centrifuge C. neoformans O / N-kulturen ved 1.700 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Fjern mediet og kassér. Vask cellerne med 5 ml 1X PBS. Centrifuger ved 1.700 xg i 10 minutter ved 4 ° C.
- Fjern PBS og vaskes med 5 ml filtreret 1x PBS. Centrifuger ved 1.700 xg i 10 minutter ved 4 ° C. Gentag dette trin 2 flere gange.
- Fjern PBS og resuspenderes i 5 ml 1X PBS.
- Foretag en seriel fortynding i PBS til opnåelse af en 1: 500 fortynding af den vaskede kulturen.
- Tilsæt 100 pi af den oprindelige prøve til 900 pi 1x PBS til opnåelse af en 1:10 fortynding.
- Tilsæt 100 pi 1:10 fortyndet prøve til 900 pi 1x PBS til opnåelse af en 1: 100 fortynding.
- Tilsæt 200 pi af 1: 100 fortyndet prøve til 800 pi 1x PBS til opnåelse af en 1: 500 dilutipå
- Tag 10 pi 1: 500 fortynding og regne hæmocytometer at beregne antallet af celler.
- Forbered arbejdet løsning til aktivering makrofager og opsoniserende C. neoformans.
- Fortynd LPS og IFNy 100x fra stamopløsninger ved tilsætning af 10 pi til 990 pi.
BEMÆRK: LPS og IFNy bruges til at forbedre fagocytisk optagelse, men er ikke påkrævet for fagocytose. Hvis der er en interesse i svampedræbende aktivitet af makrofager, udføre aktivering O / N ved 37 ° C med rystning forud for infektion. - Per prøve kombinere 7,5 pi fortyndede LPS, 1,25 pi fortyndet IFNy, 1,25 pi GXM antistof og mængden af C. neoformans kultur der giver 1,25 x 10 5 celler. Bring volumen op til 250 pi ganget med antallet af prøver med DMEM suppleret med 10% FBS og 1% P / S.
- Vortex og inkuber opløsningen i 20 minutter ved 37 ° C med omrystning.
BEMÆRK:Kolesterol depletion (trin 1,2-1,4) kan ske sideløbende med opsonisering trin. Sørg for at behandle makrofager før kombination arbejderklassen løsning, da de opsoniseret celler optimalt bør anvendes længere end 20 min efter trin 3.4.3 inkubation.
- Fortynd LPS og IFNy 100x fra stamopløsninger ved tilsætning af 10 pi til 990 pi.
- Infect makrofager
- Vask makrofager to gange med serumfrit DMEM og der tilsættes 200 pi opsoniseret C. neoformans arbejdsopløsning til hver brønd.
- Der inkuberes i 2 timer ved 37 ° C.
- Fix og pletter Cells
- Fjern mediet og vask cellerne 2 gange med DMEM.
- Lufttørre cellemonolaget i 10 minutter og tilsættes 200 pi iskold methanol for at fastsætte cellerne.
- Der inkuberes i 15 minutter ved stuetemperatur og fjerne eventuelle resterende methanol.
- Tilsæt 200 pi 10x Giemsa og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Vask 2 - 3 gange med deioniseret vand og tør O / N med hætten.
BEMÆRK: Imaging kan gøres næste dag eller op til en uge following farvning.
- Visualiser og Count
- Ved hjælp af et mikroskop, tælle 300 celler pr datapunkt (hvis der er 2 af den samme behandling tæller 150 per brønd) og bemærk antallet af smittede makrofager og antal opslugt Cryptococcus celler.
BEMÆRK: For at sikre en endnu prøveudtagning pr datapunkt brug 2 plader pr tilstand, vælge 3 ikke-overlappende områder per plade og tælle 50 celler pr område. - Beregn fagocytisk indeks ved at multiplicere procentdelen af inficerede makrofager af det gennemsnitlige antal C. neoformans pr makrofag. Normalize fagocytisk indeks ved at udtrykke værdier som en procentdel af 1x PBS-behandlede kontrol. Efter flere forsøg beregne middelværdien og standardafvigelsen af middelværdien til at bestemme udviklingen i fagocytisk indeks. Brug student t-test for at bestemme signifikans.
- Tag mikrografer af celler ved 1.000X eller 400X forstørrelse.
- Ved hjælp af et mikroskop, tælle 300 celler pr datapunkt (hvis der er 2 af den samme behandling tæller 150 per brønd) og bemærk antallet af smittede makrofager og antal opslugt Cryptococcus celler.
4. trypanblåt Assay
- I en steril biosikkerhed kabinet, frø 10 6 makrofag-lignende celler per brønd på en 6-brønds celledyrkningsplade i et volumen på 5 ml Dulbeccos minimale essentielle medium (DMEM) suppleret med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin / streptomycin . Der inkuberes ved 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
- Nedbryder makrofager af kolesterol ved at følge trin 1,2-1,4 substituere 2 ml 200 pi givet fald at tage højde for den større godt størrelse.
BEMÆRK: Sørg for at medtage en kontrol behandlet med 1x PBS samt en kontrol, som skrabes forud for enhver behandling. - Der tilsættes 500 pi 1x PBS til hver brønd og forsigtigt skrabe cellerne med en celleskraber. Overførsel til et mikrofugerør og suspendere cellerne ved forsigtigt at pipettere op og ned.
- Fjern 10 pi celler og pletten med 1 pi 4% trypanblåt.
- Tæl cellerne på et hæmocytometer og beregne levedygtighed ved hjælp af følgende ligning:% levedygtighed = [1 - (blå celler / totale celler)]x 100. Normalisér værdier til den kontrol, som var ubehandlet. Efter flere forsøg beregne middelværdien og standardafvigelsen for at bestemme udviklingen i rentabiliteten. Brug student t-test for at bestemme signifikans.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kolesterol Udtømmelse
Analyse af supernatanten reserveret i trin 1.3 i protokollen ved at følge producentens anvisninger i Amplex Red cholesterolassay kit giver en forhøjet koncentration af kolesterol i MβCD behandlede prøve sammenlignet med 1x PBS-kontrol. Afhængig af celletype og MβCD anvendte koncentration kolesterol udtynding kan variere. For J774 behandlet med 10 mM MβCD blev en udtømning af ca. 50% observeret. Depletion kan beregnes ved hjælp af værdier, der opnås fra supernatanten og cellelysat indsamlet i trin 1.4 (figur 1).
Cellelysat analyseret under anvendelse af TLC viser et markant fald i farvning af cholesterol i celler behandlet med stigende koncentration af MβCD (figur 2A). Densitometrianalyse af TLC viser en lignende tendens til kvantitativ analyse (figur 2B). Bligh-Dyer metode giver et råt extRACT af de samlede lipider og det er vigtigt at tillade passende adskillelse af lipider for at identificere den korrekte bånd udnytte kolesterol standard.
Infektion
Efter at have fulgt infektionen procedure, forbliver celler klæbet og intakt. Cell morfologi uændret mellem behandlingsgrupperne. En kontrolgruppe, der ikke er udsat for C. neoformans tjener som kontrolpunkt (figur 3). Det er muligt at opnå suboptimale resultater og kan manifestere sig som lyse af celler og andre unormale morfologier. Den mest sandsynlige årsag er forurening af cellelinien eller reagenser, der anvendes i proceduren. Mikrografer af optimalt inficerede celler viser tydeligt C. neoformans opslugt inden for pattedyrceller. Forskelle i antal fagocyteret gær kan bemærkes ved observation mellem behandlingsgrupper (figur 4). Efter beregning af fagocytisk indeks fra 300 makrofagceller pr behandlingsgruppe enreduktion fagocytisk indeks findes i kolesterol udtømte celler (figur 5). Reduktionen i den fagocytiske indeks synes ikke at være afhængig af potentielle forskelle i makrofagaktivering, selv om de kan forekomme. Udførelse af infektion i fravær af makrofag aktivatorer, men efter behandling med MCD resulterer i en tilsvarende reduktion af fagocytisk indeks (data ikke vist).
Trypan Blå
Trypan Blue-farvning anvendes til at vurdere levedygtigheden af celler efter kolesterol udtynding. Der observeres ingen ændring i levedygtighed mellem PBS-behandlede og 10 mM MCD behandlede celler. Levedygtighed synes at aflevere en smule efter behandling med 30 mM MCD, der kan forventes som følge af den ca. 75% udtømning i kolesterol (en væsentlig lipid) observeret i densitometrianalyse (figur 6 og figur 2B).
Figur 1. cholesterolindhold supernatant efter behandling. Kvantificering af kolesterol i supernatanten opsamlet fra behandlede celler viser berigelse MCD sammenlignet med 1x PBS. Kolesterol udtynding er 50 ± 5% beregnet ud fra total kolesterol i 1x PBS (supernatant + cellelysat). Fejlsøjler viser standardafvigelse (n = 5).
Figur 2. TLC af kolesterol i cellelysat og densitometri. Billede af udviklet TLC-plade visualiseret med MnCl2 forkulning. En markant fald i kolesterol ses efter MβCD behandling (A). Densitometrianalyse af bånd sammenlignet med PBS-behandlede kontrol (vist som 100%) bekræfter tendensen fundet i kolesterol kvantificering assay (B Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Ikke-inficerede kontrol mikrofotografier af behandlede J774 makrofager. Billeder af inficerede J774 celler taget ved 200X forstørrelse. Scale bar er 50 um. 1x PBS (A), 10 mM MβCD (B), og 30 mM MβCD (C) behandlede celler viser ingen ændring. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 4. Infektion af J774 makrofager medC. neoformans Billeder af inficerede J774 celler taget på 400X (øverste række A.1 - C.1). Og 1.000 x (nederste række A.2 - C.2) forstørrelse er vist. Internaliseret C. neoformans celler vises som blå-violette kugler med en lighter ring omgiver dem. Celler behandlet med 1 x PBS (A), 10 mM MβCD (B), og 30 mM MβCD (C) viser forskelle i C. neoformans optagelse. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. Fagocytisk indeks. Fagocytisk indeks er vist med hensyn til kontrolgruppen, som blev behandlet med PBS (markeret ved 100 til sammenligning). Fagocytisk indeks blev reduceret med 25% inden 10mM MβCD behandling og med næsten 55% ved 30 mM behandling. Fejlsøjler viser standardafvigelse af middelværdien (n = 4).
Figur 6. Cell levedygtighed. Variationer i cellernes levedygtighed ved trypanblåt assay viser lidt variation, når man sammenligner alle tre behandlingsgrupper. Der er et lille fald fra i levedygtighed i 30 mM MβCD behandlingsgruppe, der kan forventes fra udtynding af sådan en vigtig del af membranen. Fejlsøjler viser standardafvigelse (n = 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I arbejdet med denne protokol er det vigtigt at opnå nøjagtige celletal når plating pattedyrceller og opsoniserende C. neoformans celler. Dette minimerer variation mellem forsøg og sikrer en nøjagtig 1: 1 mål til effektorfunktion forholdet hele undersøgelsen. Det er også vigtigt at koordinere timingen af kolesterol udtømning og infektion for at forhindre opsoniseret gærceller eller behandlede makrofagceller fra hvile ved stuetemperatur i mellem procedurerne. Lange ventetider kan føre til tab af antistof opsonisering eller påfyldning af forarmet kolesterol før infektion kan begynde. Hvis eksperimenter er færdig med præcision dataanalysen giver mulighed for konklusioner, der skal skelnes om den rolle af kolesterol i fagocytose.
Begrænsningerne i teknikken forhindrer nogen konklusioner med hensyn til den særlige fremgangsmåde, hvorved kolesterol udtynding sænker fagocytiske indeks for makrofag lignende celler, og det er uklart, om effekt er direkte skyldes kolesterol eller på grund af en sekundær mekanisme. Yderligere arbejde langs denne vene undersøger andre indholdsstoffer i lipidklumper som sphingolipider eller proteiner kendt for at fungere i fagocytose som Fcy-receptoren og komplement receptor 3 2. Ændring af denne teknik til at bruge enten antistof opsonisering eller supplere alene muligt at skelne en rolle for cholesterol i et af disse kendte veje eller begge. Det er også vigtigt at huske, at MβCD udtrækker kolesterol baseret på dens hydrofobicitet og størrelse, således steroler af samme størrelse kan også udtømt, og vil migrere til en lignende sats som kolesterol på en TLC. Det er også vigtigt at bemærke, at kolesterol udtynding kan delvist påvirke makrofagaktivering, det er usandsynligt, at være ansvarlig for forskellen observeret i optagelse som udfører infektionen i fravær af IFN og LPS viser den samme reduktion i optagelsen af C. neoformans (data ikke vist), but det er af interesse, når ændre denne teknik til at studere de anti-svampe aktiviteter makrofager og rolle aktivering. Denne metode heller ikke tillade os at skelne, om kolesterol udtynding har nogen terapeutiske virkninger i svampeinfektion. Yderligere arbejde in vivo med kolesterolsænkende medicin og epidemiologiske undersøgelser af patienter, der anvender kolesterolsænkende medicin kan yderligere belyse en rolle for kolesterol udtynding i behandlingen af sygdommen og kan tilbyde en mere selektiv måde at hæmme kolesterol ophobning.
Denne procedure kan let anvendes til at undersøge optagelsen af andre patogener eller faste partikler (dvs. glaskugler) er fagocyteret og giver mulighed for undersøgelse af grundlæggende biologi af fagocytose. Ændringer kan tillade undersøgelse af andre aspekter af fagocytose ved behandling makrofagcellerne med enzymer til selektivt nedbryde andre komponenter membran eller forskellige lægemidler og inhibitorer, der kan være af interest. Det skal også bemærkes, at flowcytometri kan udgøre en mere nøjagtig og kvantitativ måde at karakterisere fagocytose og kan anvendes til at erstatte den direkte mikroskopisk tælling 24. Alt i alt dette er en forholdsvis simpel teknik, der kan bruges som udgangspunkt for mere i dybden undersøgelser, besvare spørgsmål om, hvordan lipider kan spille en vigtig rolle i infektion og immunrespons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud AI56168, AI71142, AI87541 og AI100631 til MDP. Maurizio Del Poeta er Burroughs Wellcome Investigator i infektionssygdomme.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 3460009 | |
| J774A.1 cell line | ATCC | TIB-67 | Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
| HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | Used to suplement DMEM |
| Isotemp Cell culture incubator | Fisher Scientific | Model # 3530 | |
| 96-Well culture dish | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use. |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma Life Science | C4555-10G | Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations |
| Orbital shaker | Labline | ||
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Life Technologies Molecular Probes | A12216 | All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions. |
| 96-Well Black Assay plate | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| FilterMax microplate reader | Molecular Devices | Model F5 | |
| TLC chamber | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Paper | Whatman | 3030917 | Cut down to size needed for TLC tank |
| Fume hood | Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards | ||
| 6-Well plate | Corning Inc. Costar | 3506 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Cell scraper | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Model Alegra x-30R | |
| Votex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Balance | Mettler Toledo | Model # MS104S meaures down to 0.1 mg | |
| Glass Pasteur pipette | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
| Petroleum ether | Fisher Scientific | E139-1 | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| TLC Silica Gel 60 with concentrating zone | Analytical Chromatograhy Millipore | 1.11845.0001 | |
| Iodine chips | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| Manganese chloride | Sigma-Aldrich | 244589 | |
| UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Use the Vision Works LS software for densitometry analysis | |
| Glass bottom confocal dish | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | Obtained from Duke University Medical Center | ||
| YNB | BD | 239210 | See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L. |
| Lipopolysaccharide | Sigma | L4391-1MG | Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 °C. |
| Interferon gamma | Sigma | I4777 | Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution |
| Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) | Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/ml | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 °C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month. |
| Microscope | Zeiss | Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images |
References
- Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton. Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).
- Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis. Virulence. 3, 173 (2012).
- Abadi, J., Pirofski, L. A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection. The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).
- Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice. Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).
- Casadevall, A. Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse. The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).
- Chrétien, F., et al. Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia. The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).
- Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans. The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).
- Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans. Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).
- García-Rodas, R., Zaragoza, O. Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans. FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans. Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).
- Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin. Immunology And Cell Biology. 81, Doi. 415-423 (2003).
- Sein, K. K., Aikawa, M. The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol. In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).
- Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis. Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).
- Tagliari, L., et al. Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In. Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).
- Crane, J. M., Tamm, L. K. Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes. Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).
- Brown, D. A., London, E. Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes. Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Toomre, D. Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).
- Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane. The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification). Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages. Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).
- Deshaw, M., Pirofski, L. A. Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous. In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).
- Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice. Frontiers In Microbiology. 3, 187 (2012).
- Chaka, W., et al. Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).
