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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

बृहतभक्षककोशिका कोलेस्ट्रॉल कमी और के phagocytosis पर उसके प्रभाव Published: December 19, 2014 doi: 10.3791/52432
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Molecular Genetics and Microbiology, Stony Brook University
* These authors contributed equally

Abstract

Cryptococcosis जीनस क्रिप्टोकोकस की रोगजनक कवक के कारण एक जीवन के लिए खतरा संक्रमण है। संक्रमण गहरी फेफड़ों में दोहराने में सक्षम हैं जो बीजाणुओं, की साँस लेना पर होता है। मैक्रोफेज द्वारा क्रिप्टोकोकस के phagocytosis रोग घातक meningoencephalitis पैदा करने के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में प्रसार करने के लिए सक्षम है कि तरीकों में से एक है। इसलिए, क्रिप्टोकोकस और मैक्रोफेज के बीच सहयोग के अध्ययन के संक्रमण की प्रगति को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। वर्तमान अध्ययन सी द्वारा बृहतभक्षककोशिका संक्रामकता अध्ययन करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन इन विट्रो में neoformans। इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत पर मेजबान स्टेरोल्स की भूमिका का अध्ययन किया जाता है। मिथाइल के विभिन्न सांद्रता - cyclodextrin (एमसीडी) murine जालिका सार्कोमा बृहतभक्षककोशिका की तरह सेल लाइन J774A.1 से कोलेस्ट्रॉल खाली करने के लिए इस्तेमाल किया गया। कोलेस्ट्रॉल कमी की पुष्टि की थी और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नही का उपयोग करते हुए दोनों मात्रा निर्धारितई कोलेस्ट्रॉल मात्रा का ठहराव किट और पतली परत क्रोमैटोग्राफी। कोलेस्ट्रॉल समाप्त हो कोशिकाओं Lipopolysacharide (LPS) और इंटरफेरॉन गामा (IFNγ) का उपयोग कर सक्रिय और 1 के एक प्रेरक करने वाली लक्ष्य के अनुपात में एंटीबॉडी opsonized क्रिप्टोकोकस neoformans जंगली प्रकार H99 कोशिकाओं से संक्रमित थे: 1। संक्रमित कोशिकाओं सी के साथ ऊष्मायन के दो घंटे के बाद निगरानी की गई neoformans और उनके phagocytic सूचकांक की गणना की गई। कोलेस्ट्रॉल कमी phagocytic सूचकांक में एक महत्वपूर्ण कमी के परिणामस्वरूप। प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक प्रयोगशाला वातावरण में संक्रमण की प्रक्रिया की दीक्षा नकल और संक्रामकता पर मेजबान लिपिड रचना की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करते हैं।

Introduction

Phagocytosis बाह्य संस्थाओं मेजबान कोशिकाओं से भली भाँति रहे हैं जिसके द्वारा एक प्रक्रिया है। यह रोगजनकों के खिलाफ की रक्षा करने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली के शस्त्रागार में एक महत्वपूर्ण हथियार है, लेकिन इस प्रक्रिया अक्सर internalization और शरीर एक भर में प्रसार के लिए अनुमति देने के लिए रोगजनकों द्वारा विकृत किया जा सकता है। Phagocytosis मेजबान सेल के cytoskeleton की rearrangements के माध्यम से लगाव और घिराव में परिणाम है कि कई संकेत घटनाओं द्वारा मध्यस्थता है। 'पेशेवर' फ़ैगोसाइट लगाव और रोगज़नक़ अपनी चपेट में ले और एक फेगोसोम दो रूप है जो lamellipodia के गठन के लिए संकेत करने के लिए हमलावर रोगज़नक़ की सतह पर opsonins को समझते हैं और बाध्य करने के लिए सक्षम हैं। तथाकथित 'पेशेवर' फ़ैगोसाइट अलावा मैक्रोफेज हैं। मैक्रोफेज सबसे की, बाहर की मांग और बीमारी के कारण एजेंटों को नष्ट करने, क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत, और सूजन मध्यस्थता शामिल है कि सुरक्षात्मक कार्यों के लिए बाहर ले जाने कि अति विशिष्ट कोशिकाओं रहे हैंphagocytosis 1,2 की प्रक्रिया के माध्यम से इन।

क्रिप्टोकोकस neoformans Cryptococcosis के रूप में जाना एक गंभीर बीमारी का कारण बनता है कि रोगजनक खमीर की एक प्रजाति है। क्रिप्टोकोकस बीजाणुओं मेजबान द्वारा साँस और आमतौर पर स्पर्शोन्मुख है कि एक फेफड़े के संक्रमण में परिणाम हैं। यह जोखिम बेहद प्रचलित है कि सोचा है; सर्वेक्षण में उन सभी क्रिप्टोकोकल पोलीसेकेराइड glucuronoxylomannan और अन्य अध्ययनों के लिए एंटीबॉडी था कि क्लिनिक ब्रोंक्स लेबनान अस्पताल सेंटर में पाया बाल चिकित्सा संक्रामक रोगों से 61 बच्चों का एक नमूना है, दोनों मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) असंक्रमित और संक्रमित वयस्कों 3 में व्यापकता से पता चला है 4। वायुकोशीय मैक्रोफेज सफलतापूर्वक स्पष्ट रोगज़नक़ फेफड़े के संक्रमण के लिए और ज्यादातर मामलों में प्रतिक्रिया की पहली पंक्ति रहे हैं। हालांकि, प्रतिरक्षा में अक्षम व्यक्तियों (जैसे, एचआईवी और एड्स रोगियों) में खमीर मैक्रोफेज भीतर जीवित करने में सक्षम है। इन मेंमामलों, मैक्रोफेज रोगज़नक़ की नकल के लिए एक जगह के रूप में सेवा कर सकते हैं और बीमारी 5 घातक हो जाता है, जहां केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को इसके प्रसार में मदद कर सकते - 8। 11 - यह मैक्रोफेज भी "ट्रोजन हॉर्स" मॉडल 3,9 के माध्यम से रक्त मस्तिष्क बाधा पार करने के लिए खमीर की मदद करने, तानिका में सीधे खमीर उद्धार हो सकता है कि माना जाता है। इस प्रकार, यह phagocytosis की प्रक्रिया और विशेष रूप से क्रिप्टोकोकल संक्रमण में, यह है कि प्रभावित कारकों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।

15 - अन्य रोगज़नक़ सिस्टम में पिछले काम phagocytosis 12 में खेलने के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका होने के रूप में कोलेस्ट्रॉल का गठन करके कोलेस्ट्रॉल और लिपिड राफ्ट को इंगित करें। कोलेस्ट्रॉल स्तनधारी कोशिकाओं में सबसे प्रचुर मात्रा में लिपिड प्रजाति है और 25 शामिल हैं - स्तनधारी कोशिका झिल्ली 16 का 50%। यह biop नियमन में एक भूमिका निभा पाया गया हैउनकी कठोरता 17 बदलकर झिल्ली की hysical गुण। कोलेस्ट्रॉल और sphingolipids एक साथ लिपिड rafts के रूप में जाना जाता झिल्ली के भीतर लिपिड microdomains के रूप में। 18 - लिपिड राफ्ट caveolae के गठन के साथ ही 16 संकेत के कुछ प्रकार के लिए एक अलग डोमेन उपलब्ध कराने में शामिल होने के लिए पाया गया है। कारण उनके छोटे आकार के कारण, यह vivo में लिपिड rafts के अध्ययन करने के लिए मुश्किल है। लिपिड राफ्ट की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी तरीका में अपने समर्थकों को बदलने के लिए है। मिथाइल-β-cyclodextrin (MβCD) स्तनधारी झिल्ली से कोलेस्ट्रॉल व्यय करना पाया गया है और आमतौर पर लिपिड राफ्ट 18 की भूमिका का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक यौगिक है।

इस प्रोटोकॉल में, हम मेजबान कोशिका झिल्ली से कोलेस्ट्रॉल गिरेगा और सी phagocytose के लिए मेजबान कोशिकाओं की क्षमता पर कमी के प्रभाव को यों के लिए एक विधि प्रस्तुत इन विट्रो में neoformans। यह प्रक्रिया सेल संस्कृति techniq का उपयोग करता हैसंक्रमण के लिए एक मॉडल के रूप में सेल लाइन (J774A.1) की तरह एक अमर बृहतभक्षककोशिका पर UES। कोलेस्ट्रॉल कमी स्टेरोल्स के आकार के लिए विशिष्ट एक हाइड्रोफोबिक कोर है और कोलेस्ट्रॉल झिल्ली 19 से बाहर आकर्षित करने के लिए एक सिंक के रूप में कार्य करने में सक्षम है जो MβCD, के लिए जोखिम के द्वारा पूरा किया गया था। कोलेस्ट्रॉल कमी मात्रात्मक एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग और गुणात्मक पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) 20 के बाद संशोधित Bligh-डायर लिपिड निकासी का उपयोग कर मापा गया था। । 23 - phagocytosis मैक्रोफेज सक्रिय करने के लिए इंटरफेरॉन γ और lipopolysaccharide के एक कॉकटेल के साथ मिश्रित opsonized खमीर की संस्कृति के साथ सेल लाइन से संक्रमण द्वारा मापा गया था क्रिप्टोकोकस एक glucuronoxylomannan (GXM) एंटीबॉडी 21 का उपयोग कर opsonized गया था। धुंधला हो जाना और माइक्रोस्कोपी प्रयोगों phagocytosis की डिग्री का आकलन करने के लिए कोशिकाओं के दृश्य और phagocytic सूचकांक की गणना के लिए अनुमति दी। इस प्रोटोकॉल के विकास, साथ में ले लीएक शारीरिक प्रक्रिया के साथ लिपिड संरचना में परिवर्तन है कि एकीकृत एक बुनियादी विधि escribes।

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Protocol

MβCD साथ J774A.1 प्रकोष्ठों के 1. कोलेस्ट्रॉल रिक्तीकरण

  1. एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट में, बीज 10 5 J774A.1 मैक्रोफेज कोशिकाओं की तरह अच्छी तरह से प्रति 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) के साथ पूरक Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) के 200 μl और 1% में एक 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली पर पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन (पी / एस)। 37 में सेते डिग्री सेल्सियस और 5% सीओ 2 हे / एन।
  2. सेल monolayer से मीडिया निकालें और फ़िल्टर्ड या autoclaved किया गया है कि 1x फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें।
  3. एक नियंत्रण के रूप में वांछित एकाग्रता (10 पीबीएस में मिमी या 30 मिमी) या 1x पीबीएस पर MβCD समाधान के 200 μl जोड़ें और झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं। तुरंत प्रक्रिया के बाद व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट के साथ मात्रात्मक विश्लेषण के लिए आरटी पर सतह पर तैरनेवाला और रिजर्व निकालें।
  4. 1x पीबीएस या सीरम मुक्त DMEM के साथ कोशिकाओं को दो से तीन बार धोएं और pipetti द्वारा संक्रमण या lyse कोशिकाओं के साथ जारीपतली परत क्रोमैटोग्राफी के साथ या एक किट के साथ विश्लेषण के लिए विआयनीकृत एच 2 ओ के साथ दो से तीन बार एनजी।
    नोट: एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध कोलेस्ट्रॉल मात्रा का ठहराव किट का इस्तेमाल किया जा सकता है कोलेस्ट्रॉल कमी के बाद। जानकारी के लिए सामग्री अनुभाग देखें। लिखित रूप में निर्माता के निर्देशों का पालन करें।

पतली परत क्रोमैटोग्राफी द्वारा कोलेस्ट्रॉल सामग्री की 2. अवलोकन (टीएलसी)

  1. पेट्रोलियम ईथर का एक समाधान के साथ दो बार एसीटोन के साथ और एक बार एक टीएलसी टैंक धो लें: Diethyl ईथर: एसिटिक एसिड (65: 30: 1 मात्रा द्वारा)। (मात्रा से एक 65: 30) समाधान और / एन ओ छोड़ने के एसिटिक एसिड: Diethyl ईथर: पेट्रोलियम ईथर के साथ टैंक तर।
    नोट: कार्बनिक सॉल्वैंट्स हमेशा वाष्प की साँस लेना रोकने के लिए एक धूआं हुड के तहत किया जाना चाहिए। दस्ताने और प्रयोगशाला कोट पर हर समय पहना होना चाहिए। एसिटिक एसिड एक मजबूत एसिड होता है और सावधानी के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए।
  2. 6 अच्छी तरह से सीई पर अच्छी तरह से प्रति एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट में, बीज 10 6 J774A.1 मैक्रोफेज कोशिकाओं की तरह10% FBS और 1% पी / एस के साथ पूरक गर्म DMEM के 5 मिलीलीटर की मात्रा में डालूँगा संस्कृति की थाली। 5%, 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते सीओ 2 हे / एन।
  3. 1.4 बड़े अच्छी तरह से आकार के लिए खाते में जहां लागू 200 μl के लिए 1 मिलीलीटर प्रतिस्थापन - चरणों 1.2 निम्न द्वारा कोलेस्ट्रॉल के मैक्रोफेज गिरेगा।
  4. , अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए ट्रिप्सिन-EDTA के 500 μl जोड़ें 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए सेते हैं, और धीरे से एक सेल खुरचनी के साथ कोशिकाओं को कुरेदना।
  5. एक microfuge ट्यूब में स्थानांतरण और 10% FBS और 1% पी / एस के साथ पूरक गर्म DMEM के एक अतिरिक्त 500 μl जोड़ें।
  6. 300 XG पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं स्पिन और सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
  7. सेल गोली के लिए 10% FBS और 1% पी / एस के साथ पूरक गर्म DMEM के एक अतिरिक्त 500 μl जोड़ें और ऊपर और नीचे pipetting द्वारा ध्यान resuspend।
  8. कोशिकाओं के 10 μl निकालें और एक hemocytometer पर कोशिकाओं की गिनती। प्रत्येक नमूने से सेल सांद्रता मानक के अनुसार और ग्लास ट्यूब के लिए कोशिकाओं की संख्या बराबर जोड़ें।
    नोट: इस चरण में, एक मई कोएक और अधिक केंद्रित अंतिम लिपिड निकालने प्राप्त करने के लिए एक ही इलाज समूहों से कोशिकाओं गठबंधन करने के लिए चुनते हैं।
  9. अपकेंद्रित्र कोशिकाओं मीडिया आरटी पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर और हटा दें।
  10. मेथनॉल और भंवर के 2 मिलीलीटर जोड़ें। फिर, क्लोरोफॉर्म और भंवर के 1 मिलीलीटर जोड़ें। Monophasic में यकीन समाधान बनाने के लिए चरण स्थिति की जाँच करें।
    नोट: ट्यूब 4 डिग्री सीओ / एन पर संग्रहित किया जा सकता है।
  11. आरटी पर 10 मिनट के लिए 1700 XG पर अपकेंद्रित्र और एक नया ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला
  12. DH 2 ओ के 1 मिलीलीटर द्वारा पीछा क्लोरोफॉर्म की एक अतिरिक्त 1 मिलीलीटर जोड़ें दो बार 30 सेकंड के लिए भंवर। आरटी पर 5 मिनट के लिए 1700 XG पर अपकेंद्रित्र।
  13. एक संवेदनशील संतुलन पर एक ग्लास ट्यूब वजन और ज्ञात वजन का गिलास ट्यूब में कम चरण स्थानांतरित करने के लिए एक गिलास पाश्चर विंदुक का उपयोग करें।
  14. शुष्क (लगभग 2 घंटा) जब तक एक केन्द्रापसारक बाष्पीकरण में लिपिड नीचे सूखी। सूखे लिपिड के साथ ट्यूब वजन और शुष्क लिपिड वजन की गणना।
    नोट: सूखी लिपिड टीएलसी प्रदर्शन करने के लिए तैयार है जब तक -20 डिग्री सेल्सियस में संग्रहित किया जा सकता है।
  15. (- 50 μl आमतौर पर 20) और एक सिलिका टीएलसी थाली पर पतला लिपिड का भार 20 μl लिपिड की एकाग्रता को सामान्य करने के लिए पर्याप्त क्लोरोफॉर्म में सूखे लिपिड पतला। लोड 20 एक मानक के रूप में क्लोरोफॉर्म के 20 μl में पतला कोलेस्ट्रॉल की माइक्रोग्राम प्रति।
  16. संतृप्त टीएलसी की टंकी के लिए सूखे टीएलसी थाली जोड़ें और थाली में बढ़त से पहले एक सेमी तक विस्थापित करने के लिए विलायक अनुमति देते हैं। टैंक से टीएलसी थाली निकालें और इसके बारे में 5 मिनट के सूखे के लिए अनुमति देते हैं।
  17. प्रवास की जांच करने के लिए एक आयोडीन वाष्प टैंक में रखकर लिपिड कल्पना। निकालें और स्थानों के बारे में 10 के लिए फीका करने के लिए अनुमति देते हैं - हुड के तहत 15 मिनट।
    नोट: आयोडीन एक साँस लेना खतरा है। हमेशा एक धूआं हुड के नीचे का उपयोग करें।
  18. विआयनीकृत एच 2 ओ के 60 मिलीलीटर, सल्फ्यूरिक एसिड की 4 एमएल, और मैंगनीज क्लोराइड की 630 मिलीग्राम के साथ मेथनॉल के 60 मिलीलीटर के संयोजन से तटस्थ लिपिड धुंधला के लिए एक समाधान तैयार है।
  19. ध्यान से और धीरे धीरे एक ट्रे में तटस्थ लिपिड धुंधला समाधान में टीएलसी थाली डुबकी और सिलिका एल बंद sloughing के बिना दूरAyer।
    नोट: तटस्थ लिपिड धुंधला समाधान के लिए कई बार पुन: उपयोग किया जा सकता है और इसलिए यह ट्रे से प्राप्त किया जा सकता है और बाद में उपयोग के लिए एक बोतल में वापस रख दिया गया।
  20. सभी बुलबुले गायब हो गया है जब तक थाली आरटी पर हुड के तहत शुष्क करने की अनुमति दें। इच्छित रंग के लिए एक गर्मी ब्लॉक में 160 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट और चार पर टीएलसी प्लेट हीट।
    नोट: इस तरह के विजन निर्माण रास के रूप में एक densitometry कार्यक्रम लिपिड नमूनों की तुलना करने के जले बैंड यों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

सी के साथ मैक्रोफेज की 3. संक्रमण neoformans (H99)

  1. एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट में, अच्छी तरह से DMEM के 200 μl में एक 96 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली पर प्रति बीज 10 5 मैक्रोफेज कोशिकाओं की तरह 10% FBS और 1% पी / एस के साथ पूरक। 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, 5% सीओ 2 हे / एन पर सेते हैं।
    नोट: संक्रमण भी गिलास में किया जा सकता है आसान इमेजिंग के लिए confocal व्यंजन तली; सभी राशियों ही रहते हैं।
  2. सी की एक संस्कृति विकसित neoformans (H99)एक मारा थाली से प्राप्त एक कॉलोनी के साथ YNB के 10 एमएल inoculating और झटकों के साथ 30 डिग्री सेल्सियस पर / ओ एन यह incubating द्वारा।
  3. धो और सी गिनती neoformans (H99) कोशिकाओं।
    1. अपकेंद्रित्र सी 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1700 XG पर neoformans हे / एन संस्कृति।
    2. मीडिया निकालें और त्यागने। 1x पीबीएस के 5 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1700 XG पर अपकेंद्रित्र।
    3. पीबीएस निकालें और फ़िल्टर 1x पीबीएस के 5 मिलीलीटर से धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1700 XG पर अपकेंद्रित्र। इस चरण दो से अधिक बार दोहराएँ।
    4. पीबीएस निकालें और 1x पीबीएस के 5 मिलीलीटर में resuspend।
    5. धोया संस्कृति के 500 कमजोर पड़ने: पीबीएस में एक सीरियल कमजोर पड़ने एक एक प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करें।
      1. 1:10 कमजोर पड़ने प्राप्त करने के लिए 1x पीबीएस के 900 μl करने के लिए मूल नमूना के 100 μl जोड़ें।
      2. 100 कमजोर पड़ने: एक एक प्राप्त करने के लिए 1x पीबीएस के 900 μl को 01:10 पतला नमूना के 100 μl जोड़ें।
      3. 500 diluti: एक एक प्राप्त करने के लिए 1x पीबीएस के 800 μl के लिए 100 पतला नमूना: 1 के 200 μl जोड़ेंपर
    6. 1 के 10 μl ले लो: 500 कमजोर पड़ने और कोशिकाओं की संख्या की गणना करने के लिए hemocytometer पर गिनती।
  4. सी मैक्रोफेज को सक्रिय करने और opsonizing के लिए काम कर समाधान तैयार neoformans।
    1. 990 μl करने के लिए 10 μl जोड़कर शेयर समाधान से LPS और IFNγ 100x पतला।
      नोट: LPS और IFNγ phagocytic तेज बढ़ाने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं लेकिन phagocytosis के लिए आवश्यक नहीं कर रहे हैं। मैक्रोफेज की कवकनाशी गतिविधि में रुचि है, तो संक्रमण के लिए पहले झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर सक्रियण हे / एन प्रदर्शन करते हैं।
    2. नमूना प्रति पतला LPS के 7.5 μl, पतला IFNγ के 1.25 μl, GXM एंटीबॉडी के 1.25 μl और सी की मात्रा गठबंधन 1.25 x 10 5 कोशिकाओं देता है कि neoformans संस्कृति। 10% FBS और 1% पी / एस के साथ पूरक DMEM के साथ नमूनों की संख्या से गुणा 250 μl अप करने के लिए मात्रा लाओ।
    3. भंवर और झटकों के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए समाधान सेते हैं।
      ध्यान दें:Opsonization कदम के साथ समवर्ती किया जा सकता है - कोलेस्ट्रॉल कमी (1.4 1.2 कदम)। Opsonized कोशिकाओं बेहतर कदम 3.4.3 ऊष्मायन के बाद 20 मिनट से अधिक समय नहीं इस्तेमाल किया जाना चाहिए, के रूप में काम कर समाधान के संयोजन के लिए पहले मैक्रोफेज का इलाज करने के लिए सुनिश्चित करें।
  5. मैक्रोफेज संक्रमित
    1. धो मैक्रोफेज दो बार सीरम मुक्त DMEM के साथ और opsonized सी के 200 μl जोड़ने neoformans प्रत्येक अच्छी तरह से काम कर समाधान।
    2. 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए सेते हैं।
  6. फिक्स और कोशिकाओं दाग
    1. मीडिया निकालें और DMEM के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लो।
    2. एयर 10 मिनट के लिए सेल monolayer सूखी और कोशिकाओं को ठीक करने के लिए बर्फ का ठंडा मेथनॉल के 200 μl जोड़ें।
    3. आरटी पर 15 मिनट के लिए सेते हैं और किसी भी शेष मेथनॉल हटा दें।
    4. 10x Giemsa के 200 μl जोड़ें और आरटी पर 5 मिनट के लिए सेते हैं।
    5. बंद टोपी के साथ विआयनीकृत पानी और सूखे हे / एन के साथ 3 बार - 2 धो लें।
      नोट: इमेजिंग एक सप्ताह followi करने के लिए अगले दिन किया या ऊपर जा सकता हैएनजी धुंधला।
  7. कल्पना और गणना
    1. एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करना, (अच्छी तरह से 150 प्रति गिनती एक ही इलाज के 2 अगर वहाँ) डेटा बिंदु प्रति 300 कोशिकाओं की गिनती और घिरा क्रिप्टोकोकस कोशिकाओं के संक्रमित मैक्रोफेज की संख्या और संख्या पर ध्यान दें।
      नोट:, हालत प्रति डेटा बिंदु उपयोग प्रति दो प्लेटों के नमूने भी सुनिश्चित प्लेट प्रति तीन गैर अतिव्यापी क्षेत्रों का चयन और क्षेत्र के अनुसार 50 कोशिकाओं की गिनती करने के लिए।
    2. सी का मतलब संख्या से संक्रमित मैक्रोफेज का प्रतिशत गुणा करके phagocytic सूचकांक की गणना बृहतभक्षककोशिका प्रति neoformans। 1x पीबीएस के एक प्रतिशत के नियंत्रण में इलाज के रूप में मान व्यक्त की phagocytic सूचकांक मानक के अनुसार। कई परीक्षणों के बाद मतलब मूल्य और phagocytic सूचकांक में रुझान का निर्धारण करने के मतलब की मानक विचलन की गणना। महत्व को निर्धारित करने के लिए छात्र टी परीक्षण का उपयोग करें।
    3. 1,000X या 400X बढ़ाई कोशिकाओं के micrographs ले लो।

4. Trypan ब्लू परख

  1. एक बाँझ जैव सुरक्षा कैबिनेट में, बीज 10 6 मैक्रोफेज कोशिकाओं की तरह अच्छी तरह से प्रति की मात्रा में 6 अच्छी तरह से सेल संस्कृति की थाली पर 5 से 10% भ्रूण गोजातीय सीरम और 1% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक है Dulbecco न्यूनतम आवश्यक मध्यम (DMEM) के मिलीलीटर । 5%, 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते सीओ 2 हे / एन।
  2. बड़े अच्छी तरह से आकार के लिए खाते में जहां लागू 200 μl के लिए 2 मिलीलीटर प्रतिस्थापन 1.4 - चरणों 1.2 निम्न द्वारा कोलेस्ट्रॉल के मैक्रोफेज गिरेगा।
    नोट: 1x पीबीएस के साथ ही किसी भी उपचार के लिए पहले scraped है कि एक नियंत्रण के साथ इलाज के लिए एक नियंत्रण शामिल करना न भूलें।
  3. अच्छी तरह से प्रत्येक के लिए 1x पीबीएस के 500 μl जोड़ें और धीरे से एक सेल खुरचनी के साथ कोशिकाओं को कुरेदना। एक microfuge ट्यूब में स्थानांतरण और धीरे से ऊपर और नीचे pipetting द्वारा कोशिकाओं को निलंबित।
  4. 4% Trypan नीले की एक μl साथ कोशिकाओं और दाग के 10 μl निकालें।
  5. एक hemocytometer पर कोशिकाओं की गिनती और निम्न समीकरण का उपयोग व्यवहार्यता गणना:% व्यवहार्यता = [1 - (ब्लू कोशिकाओं / कुल कोशिकाओं)]अनुपचारित था कि नियंत्रण करने के लिए x 100 मानक के अनुसार मूल्यों। कई परीक्षणों के बाद मतलब मूल्य और व्यवहार्यता में रुझान का निर्धारण करने के लिए मानक विचलन की गणना। महत्व को निर्धारित करने के लिए छात्र टी परीक्षण का उपयोग करें।

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Representative Results

कोलेस्ट्रॉल रिक्तीकरण

1x पीबीएस नियंत्रण की तुलना में Amplex लाल कोलेस्ट्रॉल परख किट में निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए प्रोटोकॉल का 1.3 चरण में आरक्षित सतह पर तैरनेवाला का विश्लेषण MβCD में इलाज के नमूने में कोलेस्ट्रॉल के एक ऊंचा एकाग्रता पैदावार। सेल के प्रकार और MβCD एकाग्रता इस्तेमाल किया कोलेस्ट्रॉल कमी के आधार पर भिन्न हो सकते हैं। 10 मिमी MβCD के साथ इलाज J774 के लिए, लगभग 50% की कमी मनाया गया। रिक्तीकरण कदम 1.4 (चित्रा 1) में एकत्र सतह पर तैरनेवाला और सेल lysate से प्राप्त मूल्यों उपयोग कर की गणना की जा सकती है।

टीएलसी का उपयोग विश्लेषण सेल lysate MβCD (2A चित्रा) की एकाग्रता बढ़ाने के साथ इलाज किया कोशिकाओं में कोलेस्ट्रॉल का धुंधला में एक उल्लेखनीय कमी को दर्शाता है। टीएलसी की densitometry विश्लेषण मात्रात्मक परख (चित्रा 2 बी) के लिए एक समान प्रवृत्ति को दर्शाता है। Bligh-डायर विधि एक कच्चे ext के लिए देता हैकुल लिपिड की ract और यह कोलेस्ट्रॉल के मानक का उपयोग सही बैंड की पहचान करने के क्रम में लिपिड की पर्याप्त जुदाई के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक है।

संक्रमण

संक्रमण प्रक्रिया का पालन करने के बाद, कोशिकाओं पालन और बरकरार रहेगा। सेल आकृति विज्ञान उपचार समूहों के बीच अपरिवर्तित बनी हुई है। सी उजागर करने के लिए नहीं किया गया है कि एक नियंत्रण समूह neoformans एक चौकी (चित्रा 3) के रूप में कार्य करता है। यह suboptimal परिणाम प्राप्त करने के लिए संभव है और कोशिकाओं और अन्य असामान्य morphologies की सेल के रूप में प्रकट हो सकता है। सबसे संभावित कारण प्रक्रिया में इस्तेमाल सेल लाइन या अभिकर्मकों का संक्रमण है। बेहतर संक्रमित कोशिकाओं की micrographs स्पष्ट रूप से सी दिखाने neoformans स्तनधारी कोशिकाओं के भीतर फंसे। Phagocytized खमीर की संख्या में अंतर उपचार समूहों के बीच अवलोकन (चित्रा 4) से उल्लेख किया जा सकता है। इलाज के समूह एक प्रति 300 मैक्रोफेज कोशिकाओं से phagocytic सूचकांक की गणना के बादphagocytic सूचकांक में कमी कोलेस्ट्रॉल समाप्त हो कोशिकाओं (चित्रा 5) में पाया जाता है। वे तब हो सकती है, हालांकि phagocytic सूचकांक में कमी, बृहतभक्षककोशिका सक्रियण में संभावित मतभेद पर निर्भर होने के लिए प्रकट नहीं होता है। बृहतभक्षककोशिका activators के अभाव में संक्रमण प्रदर्शन, लेकिन phagocytic सूचकांक की एक ऐसी ही कमी में दिल्ली नगर निगम के परिणामों के साथ उपचार के बाद (डेटा) नहीं दिखाया।

Trypan ब्लू

Trypan ब्लू धुंधला कोलेस्ट्रॉल कमी के बाद कोशिकाओं की व्यवहार्यता का आकलन करने के लिए प्रयोग किया जाता है। पीबीएस इलाज किया और 10mm एमसीडी कोशिकाओं में इलाज के बीच व्यवहार्यता में कोई परिवर्तन नहीं मनाया जाता है। व्यवहार्यता densitometry विश्लेषण (चित्रा 6 और चित्रा 2B) में मनाया कोलेस्ट्रॉल में लगभग 75% कमी की वजह से उम्मीद की जा सकती है जो 30 मिमी एमसीडी, (एक अनिवार्य लिपिड) के साथ उपचार के बाद थोड़ा दूर ड्रॉप करने के लिए प्रकट होता है।

चित्रा 1 पीबीएस 1x जब की तुलना में बाद उपचार। इलाज कोशिकाओं से एकत्र सतह पर तैरनेवाला में कोलेस्ट्रॉल की मात्रा पर तैरनेवाला चित्रा 1. कोलेस्ट्रॉल सामग्री एमसीडी में संवर्धन से पता चलता है। कोलेस्ट्रॉल कमी 1x पीबीएस (सतह पर तैरनेवाला + सेल lysate) में कुल कोलेस्ट्रॉल से गणना की 50 ± 5% है। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन शो (एन = 5)।

चित्रा 2
सेल lysate और densitometry। MnCl दो charring के साथ कल्पना विकसित टीएलसी थाली की छवि में कोलेस्ट्रॉल की 2. टीएलसी चित्रा। कोलेस्ट्रॉल में एक उल्लेखनीय कमी MβCD उपचार (ए) के बाद देखा जाता है। पीबीएस (100% के रूप में दिखाया गया है) नियंत्रण में इलाज की तुलना में बैंड के densitometry विश्लेषण (बी कोलेस्ट्रॉल मात्रा का ठहराव परख में पाया प्रवृत्ति की पुष्टि इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 3
चित्रा इलाज किया J774 मैक्रोफेज 3. असंक्रमित नियंत्रण micrographs। 200X बढ़ाई लिया असंक्रमित J774 कोशिकाओं की छवियाँ। स्केल बार 50 माइक्रोन है। 1x पीबीएस (ए), 10 मिमी MβCD (बी), और 30 मिमी MβCD (सी) इलाज कोशिकाओं कोई बदलाव नहीं दिखा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
J774 चित्रा 4. संक्रमण के साथ मैक्रोफेजसी neoformans 400X में लिया संक्रमित J774 कोशिकाओं की छवियों (शीर्ष पंक्ति A.1 - C.1)। और 1,000X (नीचे पंक्ति है A.2 - C.2) बढ़ाई दिखाए जाते हैं। भली सी neoformans कोशिकाओं उन्हें आसपास के एक लाइटर की अंगूठी के साथ नीली वायलेट क्षेत्रों के रूप में दिखाई देते हैं। 1x पीबीएस (ए), 10 मिमी MβCD (बी), और 30 मिमी MβCD (सी) सी में शो मतभेदों के साथ इलाज किया कोशिकाओं neoformans तेज। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5. phagocytic सूचकांक। Phagocytic सूचकांक (तुलना के लिए 100 में चिह्नित) पीबीएस के साथ इलाज किया गया था कि नियंत्रण समूह के लिए सम्मान के साथ दिखाया गया है। Phagocytic सूचकांक 10 से 25% तक कम हो गया थामिमी 30 मिमी उपचार द्वारा उपचार और लगभग 55% से MβCD। त्रुटि सलाखों के मतलब की मानक विचलन शो (एन = 4)।

चित्रा 6
सभी तीन उपचार समूहों की तुलना करते समय चित्रा 6 सेल व्यवहार्यता। Trypan नीले परख द्वारा सेल व्यवहार्यता में बदलाव थोड़ा बदलाव दिखा। झिल्ली के इस तरह के एक प्रमुख घटक की कमी से उम्मीद की जा सकती है, जो 30 मिमी MβCD उपचार समूह में व्यवहार्यता में बंद एक मामूली कमी आई है। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन शो (एन = 4)।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल के साथ काम करने में यह सी स्तनधारी कोशिकाओं चढ़ाना और opsonizing जब सही कोशिकाओं की गिनती प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है neoformans कोशिकाओं। इस परीक्षण के बीच भिन्नता को कम करता है और एक सटीक एक सुनिश्चित करता है: अध्ययन के दौरान प्रेरक अनुपात करने के लिए एक लक्ष्य। यह भी प्रक्रियाओं के बीच में आरटी पर आराम से opsonized खमीर कोशिकाओं या इलाज मैक्रोफेज कोशिकाओं को रोकने के लिए कोलेस्ट्रॉल कमी और संक्रमण के समय समन्वय स्थापित करने के लिए महत्वपूर्ण है। संक्रमण शुरू करने से पहले लंबे समय से प्रतीक्षा अवधि एंटीबॉडी opsonization की हानि या समाप्त कोलेस्ट्रॉल की भरपाई करने के लिए ले जा सकता है। प्रयोगों परिशुद्धता के साथ किया जाता है, तो निष्कर्ष phagocytosis में कोलेस्ट्रॉल की भूमिका के बारे में discerned किया जा करने के लिए डेटा विश्लेषण की अनुमति देता है।

तकनीक की सीमाओं कोलेस्ट्रॉल कमी कोशिकाओं की तरह बृहतभक्षककोशिका की phagocytic सूचकांक को कम करती है जिसके द्वारा विशिष्ट तंत्र के रूप में किसी भी निष्कर्ष को रोकने, और यह एफई स्पष्ट नहीं है किfect कारण कोलेस्ट्रॉल करने के लिए या कारण एक माध्यमिक तंत्र को सीधे है। इस शिरा के साथ आगे काम ऐसे Fcγ रिसेप्टर और पूरक रिसेप्टर के रूप में phagocytosis में कार्य करने के लिए जाना जाता है sphingolipids या प्रोटीन के रूप में लिपिड राफ्ट के अन्य घटकों की जांच 3 2। के लिए एक भूमिका भेद मदद कर सकता है एंटीबॉडी opsonization भी उपयोग या अकेले पूरक करने के लिए इस तकनीक को संशोधित करना इन ज्ञात रास्ते में से एक या दोनों में कोलेस्ट्रॉल। यह MβCD अपने hydrophobicity और आकार, प्रकार एक समान आकार की स्टेरोल्स भी समाप्त हो सकता है और एक टीएलसी पर कोलेस्ट्रॉल के रूप में एक समान दर पर विस्थापित हो जाएगा पर आधारित कोलेस्ट्रॉल अर्क भी याद है कि महत्वपूर्ण है। यह भी आंशिक रूप से बृहतभक्षककोशिका सक्रियण को प्रभावित कर सकते हैं कि कोलेस्ट्रॉल कमी नोट करना महत्वपूर्ण है, इस IFN- और LPS के अभाव में संक्रमण प्रदर्शन के रूप में तेज में मनाया अंतर के लिए जिम्मेदार होने के लिए सी के तेज में एक ही कमी की संभावना नहीं पता चलता है neoformans (नहीं दिखाया डेटा), बूयह ब्याज की है टी मैक्रोफेज की विरोधी कवक गतिविधियों और एक्टिवेशन की भूमिका का अध्ययन करने के लिए इस तकनीक को संशोधित करने के लिए जब। इस विधि को भी हमें कोलेस्ट्रॉल कमी कवक संक्रमण में किसी भी चिकित्सकीय प्रभाव पड़ता है कि क्या विचार करने के लिए अनुमति नहीं है। कोलेस्ट्रॉल दवाओं और आगे रोग के उपचार में कोलेस्ट्रॉल कमी के लिए एक भूमिका को स्पष्ट कर सकता है और कोलेस्ट्रॉल संचय को बाधित करने के लिए एक अधिक चयनात्मक रास्ता प्रदान कर सकता है कोलेस्ट्रॉल दवाओं का उपयोग कर रोगियों के महामारी विज्ञान के अध्ययन के साथ vivo में आगे काम।

इस प्रक्रिया को आसानी से अन्य रोगज़नक़ों या ठोस कणों के तेज अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (यानी, कांच के मोती) phagocytized और phagocytosis की बुनियादी जीव विज्ञान के अध्ययन के लिए अनुमति देने जा रहा है। संशोधन चुनिंदा अन्य झिल्ली घटकों या विभिन्न दवाओं और अंतर का हो सकता है जो अवरोधकों नीचा करने के लिए एंजाइमों के साथ मैक्रोफेज कोशिकाओं के इलाज से phagocytosis के अन्य पहलुओं के अध्ययन के लिए अनुमति दे सकता हैस्था। यह भी फ्लो phagocytosis चिह्नित करने के लिए एक और अधिक सटीक और मात्रात्मक तरीके से प्रस्तुत कर सकता है और प्रत्यक्ष सूक्ष्म गणना 24 की जगह इस्तेमाल किया जा सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। कुल मिलाकर, इस लिपिड संक्रमण और प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं के बारे में सवाल का जवाब है कि गहराई से अध्ययन में अधिक के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक काफी सरल तकनीक है।

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Acknowledgments

इस काम एनआईएच अनुदान एमडी पी को AI56168, AI71142, AI87541 और AI100631 द्वारा समर्थित किया गया। Maurizio डेल पोएता संक्रामक रोगों में बरोज़ वेलकम अन्वेषक है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Class II type A2 Biosafety Cabinet Labconco 3460009
J774A.1 cell line ATCC TIB-67 Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco 11995-065 Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use
HI Fetal Bovine Serum Performance Plus Gibco 10082-147 Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) Gibco 15140-122 Used to suplement DMEM
Isotemp Cell culture incubator Fisher Scientific Model # 3530
96-Well culture dish Corning Inc. Costar 3595
10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BioReagents BP3994 Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.
Methyl-β-cyclodextrin Sigma Life Science C4555-10G Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations
Orbital shaker Labline
Amplex Red Cholesterol Assay Kit Life Technologies Molecular Probes A12216 All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.
96-Well Black Assay plate Corning Inc. Costar 3603
FilterMax microplate reader Molecular Devices Model F5
TLC chamber Sigma-Aldrich Z126195-1EA
Chloroform Sigma-Aldrich 650498-4L
Methanol Sigma-Aldrich 34860-2L-R
TLC Paper Whatman 3030917 Cut down to size needed for TLC tank
Fume hood Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards
6-Well plate Corning Inc. Costar 3506
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Cell scraper Corning Inc. Costar 3010
Hemocytometer Hausser Scientific 1490
Centrifuge Beckman Coulter Model Alegra x-30R
Votex mixer Fisher Scientific 12-812
Balance Mettler Toledo Model # MS104S meaures down to 0.1 mg
Glass Pasteur pipette Fisherbrand 13-678-20A
Cholesterol Avanti Polar Lipids 700000
SpeedVac concentrator Thermo Scientific Model # SPD2010
Petroleum ether Fisher Scientific E139-1
Diethyl ether Sigma-Aldrich 309966
Acetic acid Sigma-Aldrich 320099
TLC Silica Gel 60 with concentrating zone Analytical Chromatograhy Millipore 1.11845.0001
Iodine chips Sigma-Aldrich 376558-50G
Sulfuric acid Sigma-Aldrich 320501
Manganese chloride Sigma-Aldrich 244589
UVP EC3 Imaging System Ultra-Violet Products Ltd. Use the Vision Works LS software for densitometry analysis
Glass bottom confocal dish MatTek P35G-1.5-10C www.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99) Obtained from Duke University Medical Center
YNB BD 239210 See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L.
Lipopolysaccharide Sigma L4391-1MG Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 °C.
Interferon gamma Sigma I4777 Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution
Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/ml
Giemsa MP Biomedicals 194591 Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 °C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.
Microscope Zeiss Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images

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References

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इम्यूनोलॉजी अंक 94 संक्रमण phagocytosis, कोलेस्ट्रॉल cyclodextrin मैक्रोफेज
बृहतभक्षककोशिका कोलेस्ट्रॉल कमी और के phagocytosis पर उसके प्रभाव<em&gt; क्रिप्टोकोकस neoformans</em
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Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor,… More

Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (94), e52432, doi:10.3791/52432 (2014).

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