Utilisation de la souris des cellules tumorales mammaires pour enseigner Biologie Concepts de base: un module de laboratoire simple

Summary

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

Abstract

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

Introduction

Souvent, dans les cours de biologie générale de premier cycle, les sujets de la régulation du cycle cellulaire et le cancer sont abordées mais pas examinés en détail parce que la portée du contenu de ces cours laisse peu de temps pour la profondeur. En outre, les étudiants en biologie de premier cycle ne sont pas généralement exposés aux techniques de pointe associés à la culture de cellules animales. Pour aider les élèves à développer une compréhension plus profonde de ces concepts, tout en appliquant et en analysant ce qu'ils ont appris, une activité de laboratoire a été développé comme une modification de l'Institut Walter Reed de l'armée de recherche (WRAIR) a étendu l'activité du laboratoire ^1. Le module de laboratoire utilise une stratégie expérimentale par étapes qui comprend les voies de signalisation cellulaire aberrante croissance et la caractérisation d'un modèle de cellule cancéreuse, le développement et l'exécution de méthodes de comptage des cellules, en établissant cours et les dosages de temps optimal pour le traitement de cellules avec des agents anti-prolifératifs, et l'identification . L'expérience permet également ouverte-ended enquête.

La plupart des techniques nécessaires à cette activité peut être accompli dans un laboratoire typique de biologie-enseignement. L'activité commence par les étudiants caractérisant la vitesse de la morphologie et de croissance de la lignée cellulaire de tumeur mammaire de souris (MMT), un modèle de cancer du sein humain ^2. Le cancer du sein a été choisi comme le cancer du modèle en raison de sa prévalence dans la population, de la connaissance des étudiants des collèges d'âge, et les données disponibles répandues. La lignée cellulaire MMT a été spécialement choisie parce qu'elle est facile à obtenir, bien caractérisé, a un temps de doublement est court et facile à cultiver. En outre, les cellules MMT sont oestrogéno-dépendante qui est compatible avec la plupart des cancers du sein féminin. Les élèves identifient ensuite les voies de signalisation cellulaires aberrantes dans les cellules MMT en traitant les cellules avec des médicaments de chimiothérapie dont le mécanisme d'action est bien établie.Procédé concentration des médicaments et de la durée des traitements sont variés permettant aux étudiantspour évaluer l'effet de ces variables sur le taux de division cellulaire. Le dosage de cette activité clé est la détermination de la viabilité cellulaire, ce qui nécessite simplement comptage de cellules, en utilisant l'une des deux méthodes. Chaque méthode dépend des compétences de microscopie fortes. Les élèves déterminent la viabilité des cellules en utilisant une norme, méthode de hémocytomètre et une méthode de photomicroscopie roman et proposent. Selon leurs constatations, ils peuvent proposer et tester des modifications à l'activité. Les étudiants représentent alors leurs données et interpréter les résultats d'affiner leur hypothèse et concevoir de nouvelles stratégies expérimentales.

Cette activité de laboratoire est adapté pour les première année ou de niveau de deuxième année les étudiants se spécialisant dans les sciences biologiques. Il est condensé dans un module de laboratoire d'une semaine qui peut être complété dans une première année, la biologie générale ou la deuxième année, cellulaire / moléculaire cours de biologie. Les compétences nécessaires pour le bon achèvement de l'activité comprennent l'arithmétique de base et de l'algèbre, la familiarité avec un tableau de ccompétences de laboratoire de minerai (par exemple, le pipetage, solution de décisions, une technique stérile), l'analyse des données, la gestion de base de la microscopie optique et l'heure, ainsi que des connaissances de l'instructeur de la culture cellulaire et un tableur. Réactifs nécessaires comprennent un modèle de lignée cellulaire animale de cancer (par exemple, des cellules mammaires de souris de tumeurs, de TEM ^2), des agents chimiothérapeutiques (par exemple, le tamoxifène, la curcumine, la metformine, et l'aspirine), trypan milieux de culture bleu et cellulaire (par exemple, de Eagle du milieu essentiel minimum ; EMEM) avec des suppléments appropriés (par exemple, des chevaux de donateurs et de sérum de veau foetal). Instruments nécessaires comprennent une lumière microscope inversé avec l'attachement appareil photo numérique, ordinateur, 100 mm et 24 plaques de culture de tissu, incubateur à CO ₂ (ou équivalent), enceinte de sécurité biologique (BSC; Classe II), hémocytomètre, et le logiciel de microscopie numérique.

Il ya de bons exemples d'activités spécifiques de laboratoire qui reposent sur la culture de cellules animales à Teach étudiants de premier cycle sur les concepts de la biologie cellulaire ^3. Cependant beaucoup exigent des fournitures ou des techniques qui ne sont pas facilement accessibles (par exemple, des isotopes radioactifs, des tissus d'animaux vivants, de l'équipement d'imagerie de pointe ^1,4,5), décrivent les protocoles qui sont assez avancé (par exemple, approprié pour un cours 400 de niveau ^6), ou exiger plusieurs semaines ou semestre projets longs ^6,7. L'activité de laboratoire décrit ici est simple et peut être réalisée en une seule semaine avec des équipements de laboratoire commun.

En résumé, ce module de laboratoire introduit efficacement ou renforce les concepts de cycle cellulaire, voies de signalisation cellulaire et le cancer tout en enseignant les compétences de laboratoire de base et avancées, l'analyse des données expérimentales, la méthode de culture de cellules animales et le processus scientifique. Le module de laboratoire est simple et économiquement accessible et fournit à la fois la flexibilité et la possibilité pour les questions ouvertes. L'activité encourage la créativité de l'étudianten fournissant un modèle de stratégie expérimentale qui agit comme un guide, mais pas une recette. Plus important encore, les satisfait d'activité tous les domaines d'apprentissage de la taxonomie de Bloom ⁸ car elle nécessite la mémoire, la compréhension, l'application, l'analyse, l'évaluation et la création en engageant les élèves dans un processus qui les tire du manuel et dans le monde de la recherche scientifique.

Protocol

Notes: conduite tous les travaux avec des cellules et des réactifs de culture cellulaire dans une armoire de biosécurité de classe II (BSC) 9. Cellules MMT sont classés comme la biosécurité de niveau I, car elles posent risque faible à modéré biologique. Appliquer les procédures de nettoyage et de décontamination appropriées pour le BSC entre les utilisations (par exemple, la lumière ultraviolette, 70% d'éthanol essuyer). 1. Cultiver les cellules MMT <…

Representative Results

Growing MMT cells and comparing counting methods. Mouse mammary tumor cells were successfully grown and characterized (Figure 1) and a novel cell counting method developed using Motic Software, a digital camera-associated software program for a microscope. This new cell counting method was compared to a traditional counting method employing a hemocytometer (Figure 2) and was shown to be equally accurate in determining cell number (Table 1</str…

Discussion

A lab module is presented that aims to teach a variety of topics in cell biology through the advanced techniques of animal cell culture. The module achieves this by analyzing the effects of a number of anti-proliferative chemicals on the replication of cells that model human breast cancer. The primary assay relies on the fundamental technique of cell counting and introduces a novel way to count cells using microscopy software. The activities comprising the module can be conducted with instruments and equipment available …

Materials

Tissue Culture Hood	ESCO Labculture Reliant		Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Waterjactor CO2 Incubator	CEDCO	Model 1510
Bright-line Hemocytometer	American Optical		with two separate grids
Motic Images Plus			Mac OSX Verison 2.0 or higher
Gilson Pipetman	Rainin instrument co. inc		P-20D, P-200D, P-1000D
CK30/CK40 Culture Microscope	Olympus		4 objective inverted light microscope with camera
200 uL Pipet tips	MidSci	40200C
1000 uL Pipet tips	MidSci	AVR4
10 mL Seriological Pipets	TPP	TP94010
24-well plates	CoStar- Tissue Culture Cluster	3524	24 wells, 16 mm well diameter, Radiation sterilized
Trypan Blue Solution 0.4%	Sigma	T8154	100 mL, cell culture tested non-haz
Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz	Sigma	Z375357
Mouse Mammary Tumor(MMT) cells	ATCC	CCL-51
Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM)	ATCC	30-2003	500 mL
Fetal Bovine Serum	Sigma	F0926	500 mL
Meformin Hydrochloride	Sigma	PHR1084	500 mg
Tamoxifen	Sigma	T5648	white or white-yellow powder
Curmumin	Sigma	C1386	yellow-orange powder
Aspirin	Sigma	A2093	meets USP testing specifications