Usando o rato do mamárias Células Tumorais para ensinar Biologia Conceitos Básicos: A Módulo Lab Simples

Summary

A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.

Abstract

Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.

Introduction

Muitas vezes, nos cursos de graduação de biologia geral, os temas da regulação do ciclo celular e câncer são aflorados, mas não explorados em detalhe porque a amplitude do conteúdo nestes cursos deixa pouco tempo para a profundidade. Além disso, alunos de graduação de biologia não são normalmente expostos a técnicas avançadas associadas com a cultura de células animais. Para ajudar os alunos a desenvolver uma compreensão mais profunda destes conceitos, ao aplicar e analisar o que aprenderam, uma atividade de laboratório foi desenvolvido como uma modificação do Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) estendeu atividade laboratorial ^1. O módulo de laboratório utiliza, uma estratégia experimental passo a passo que inclui a crescer e caracterizar um modelo celular de cancro, desenvolvimento e execução de métodos de contagem de células, é claro, que estabelece o tempo óptimo e dosagens para o tratamento de células com agentes anti-proliferativos, e identificação de vias de sinalização celular aberrante . O experimento também permite aberta-ended inquérito.

A maioria das técnicas necessárias para esta actividade pode ser realizado num laboratório-ensinando biologia típico. A actividade inicia-se com os alunos que caracterizam a taxa de crescimento e morfologia da linha celular de tumor mamário de ratinho (MMT), um modelo de cancro da mama humano ^2. O câncer de mama foi escolhido como o câncer de modelo por causa de sua prevalência na população, sua familiaridade aos estudantes em idade universitária, e os dados difundidos disponíveis. A linha de células MMT foi especificamente seleccionada porque é facilmente obtido, bem caracterizado, tem um curto tempo de duplicação e é fácil de cultivar. Além disso, as células MMT são o que é consistente com a maioria dos cancros da mama dependente de estrogénio do sexo feminino. Depois, os estudantes identificar vias de sinalização celular aberrante nas células MMT por tratamento das células com drogas de quimioterapia cujo mecanismo de acção é bem established.The concentração dos fármacos e duração dos tratamentos são variados permitindo que os alunospara avaliar o efeito destas variáveis ​​na taxa de divisão celular. O ensaio de chave para esta actividade é a determinação da viabilidade das células, o que requer simplesmente a contagem das células, utilizando um dos dois métodos. Cada método depende das habilidades de microscopia fortes. Estudantes determinar a viabilidade celular, utilizando um padrão, método hemocit�etro e um método microfotografia romance e propor. Baseado em seus resultados, eles podem propor e testar modificações para a atividade. Os alunos, então, representar seus dados e interpretar os resultados para refinar a sua hipótese e elaborar novas estratégias experimentais.

Esta atividade de laboratório é adequado para caloiro ou nível de estudante de segundo ano estudantes que se formam nas ciências biológicas. Ele é condensado em um módulo de laboratório de uma semana, que pode ser completada em um primeiro ano, biologia geral ou no segundo ano, curso de biologia celular / molecular. Habilidades necessárias para a boa execução da atividade incluem aritmética básica e álgebra, a familiaridade com uma variedade de chabilidades laboratoriais de minério (por exemplo, pipetagem, a tomada de solução, uma técnica estéril), análise de dados, microscopia de luz e tempo de gestão de base, juntamente com o conhecimento instrutor de cultura de células e software de planilha. Reagentes requeridos incluem um modelo de linha de células de animais para o cancro (por exemplo, células de mamário de ratinho de tumor, MMT ^2), agentes quimioterapêuticos (por exemplo, tamoxifeno, a curcumina, a metformina, e aspirina), tripano meios de cultura azul e células (por exemplo, Meio Essencial Mínimo de Eagle ; EMEM) com suplementos apropriados (por exemplo, cavalos doador e soro fetal bovino). Instrumentos necessários incluem um microscópio invertido luz com apego câmera digital, computador, 100 mm e 24 placas de cultura de tecidos, incubadora de _CO2 (ou equivalente), cabine de segurança biológica (BSC; Classe II), hemocitômetro, e software de microscopia digital.

Existem bons exemplos de atividades de laboratório específicos que dependem de cultura de células animais para TEACestudantes de graduação h sobre conceitos em biologia celular ^3. No entanto, muitos requerem fontes ou técnicas que não são facilmente acessíveis (por exemplo, isótopos radioativos, tecido animal vivo, equipamentos avançados de imagem ^1,4,5), descrever os protocolos que são bastante avançada (por exemplo, adequado para um curso de nível ⁶ 400), ou exigem multi-semana ou semestrais longas projetos ^6,7. A atividade de laboratório descrito aqui é simples e pode ser realizado em uma única semana com equipamento de laboratório comum.

Em resumo, este módulo de laboratório efetivamente introduz ou reforça os conceitos de ciclo celular, vias de sinalização celular e câncer, enquanto o ensino de habilidades básicas e avançadas de laboratório, análise de dados experimentais, o método de cultura de células animais e do processo científico. O módulo de laboratório é simples e economicamente acessível e fornece a flexibilidade ea oportunidade para o inquérito aberto. A atividade incentiva a criatividade dos estudantesfornecendo uma estratégia modelo experimental que actua como uma guia, mas não uma receita. Mais importante ainda, os satisfaz todos os domínios de actividade de aprendizagem de flores Taxonomia ^8, pois requer lembrando, compreensão, aplicação, análise, avaliação e criação de envolver os alunos em um processo que os puxa para fora do livro didático e para o mundo da pesquisa científica.

Protocol

Notas: Conduta todo o trabalho com células e reagentes de cultura de células em uma cabine de segurança biológica Classe II (BSC) 9. Células MMT são classificados como Nível de Biossegurança eu, como eles representam baixo risco biológico a moderada. Aplicar os procedimentos de limpeza e descontaminação adequados para o BSC entre os usos (por exemplo, luz ultravioleta, 70% de etanol limpar). 1. Cultivar células MMT Cultivar células em placas de 10 …

Representative Results

Crescer células MMT e comparando métodos de contagem. Células de tumor mamário foram cultivadas com sucesso e caracterizado (Figura 1) e um método de contagem de células novo desenvolvido usando Motic Software, um programa digital de software associado a câmara por um microscópio. Este novo método de contagem de células foi comparada com um método de contagem tradicional utilizando um hemocitómetro (Figura 2) e mostrou-se igualmente efic…

Discussion

Um módulo de laboratório é apresentado que tem como objetivo ensinar uma variedade de tópicos em biologia celular através das avançadas técnicas de cultura de células animais. O módulo realiza esta análise dos efeitos de uma série de produtos químicos anti-proliferativos sobre a replicação de células que modelo de cancro da mama humano. O ensaio primário se baseia na técnica fundamental da contagem de células e introduz uma nova maneira de contar as células utilizando software de microscopia. As activ…

Materials

Tissue Culture Hood	ESCO Labculture Reliant		Class II Type A2 Biological Safety Cabinet
Waterjactor CO2 Incubator	CEDCO	Model 1510
Bright-line Hemocytometer	American Optical		with two separate grids
Motic Images Plus			Mac OSX Verison 2.0 or higher
Gilson Pipetman	Rainin instrument co. inc		P-20D, P-200D, P-1000D
CK30/CK40 Culture Microscope	Olympus		4 objective inverted light microscope with camera
200 uL Pipet tips	MidSci	40200C
1000 uL Pipet tips	MidSci	AVR4
10 mL Seriological Pipets	TPP	TP94010
24-well plates	CoStar- Tissue Culture Cluster	3524	24 wells, 16 mm well diameter, Radiation sterilized
Trypan Blue Solution 0.4%	Sigma	T8154	100 mL, cell culture tested non-haz
Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz	Sigma	Z375357
Mouse Mammary Tumor(MMT) cells	ATCC	CCL-51
Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM)	ATCC	30-2003	500 mL
Fetal Bovine Serum	Sigma	F0926	500 mL
Meformin Hydrochloride	Sigma	PHR1084	500 mg
Tamoxifen	Sigma	T5648	white or white-yellow powder
Curmumin	Sigma	C1386	yellow-orange powder
Aspirin	Sigma	A2093	meets USP testing specifications