Ved hjelp av musen Brysttumorceller i Teach Kjerne Biologi Concepts: En enkel Lab Module
Summary
A feasible laboratory module for biology undergraduates that explores advanced cellular and molecular concepts using animal cell culture is described. Students grow, characterize and manipulate a breast cancer cell model by exposure to chemotherapy agents. Cell viability is assayed through cell counting using both a standard and novel method.
Abstract
Undergraduate biology students are required to learn, understand and apply a variety of cellular and molecular biology concepts and techniques in preparation for biomedical, graduate and professional programs or careers in science. To address this, a simple laboratory module was devised to teach the concepts of cell division, cellular communication and cancer through the application of animal cell culture techniques. Here the mouse mammary tumor (MMT) cell line is used to model for breast cancer. Students learn to grow and characterize these animal cells in culture and test the effects of traditional and non-traditional chemotherapy agents on cell proliferation. Specifically, students determine the optimal cell concentration for plating and growing cells, learn how to prepare and dilute drug solutions, identify the best dosage and treatment time course of the antiproliferative agents, and ascertain the rate of cell death in response to various treatments. The module employs both a standard cell counting technique using a hemocytometer and a novel cell counting method using microscopy software. The experimental procedure lends to open-ended inquiry as students can modify critical steps of the protocol, including testing homeopathic agents and over-the-counter drugs. In short, this lab module requires students to use the scientific process to apply their knowledge of the cell cycle, cellular signaling pathways, cancer and modes of treatment, all while developing an array of laboratory skills including cell culture and analysis of experimental data not routinely taught in the undergraduate classroom.
Introduction
Ofte i lavere generell biologi kurs, blir temaene cellesyklus regulering og kreft berørt, men ikke utforsket i detalj fordi bredden i innholdet i disse kursene gir lite tid til dybde. I tillegg er lavere biologistudenter vanligvis ikke utsatt for de avanserte teknikker forbundet med animalsk cellekultur. For å hjelpe studentene utvikle en dypere forståelse av disse begrepene, mens søknad og analysere hva de har lært, ble et laboratorium aktivitet utviklet som en modifikasjon av Walter Reed Army Institute of forskning (WRAIR) utvidet laboratorium aktivitet 1. Laboratoriet modulen bruker en trinnvis, eksperimentell strategi som omfatter vokser og karakterisere en kreftcelle-modell, utvikling og gjennomføring av celletellingsmetoder, å etablere optimal tidsforløp og doser for behandling av celler med anti-proliferative midler, og identifisering av avvikende celle-signalveier . Forsøket gir også mulighet for åpen-ended henvendelse.
De fleste av de teknikker som kreves for denne aktiviteten kan utføres på en typisk biologi-undervisning laboratorium. Aktiviteten starter med elevene karakteriserer morfologi og vekst av musen bryst tumor (MMT) cellelinje, en modell for menneskelig brystkreft to. Brystkreft ble valgt som modell kreft på grunn av sin utbredelse i befolkningen, sin kjennskap til college-alderen studenter, og den utbredte data tilgjengelig. MMT-cellelinjen ble spesifikt valgt fordi den er lett oppnåelig, godt karakterisert, har en kort doblingstid og er lett å vokse. I tillegg er MMT-celler er østrogenavhengig, som er forenlig med de fleste kvinnelige brystkreft. Studenter deretter identifisere avvikende celle-signalveier i MMT cellene ved å behandle cellene med cellegift som virkningsmekanismen er vel established.The konsentrasjon av narkotika og lengden av behandlingene er variert slik at elevenefor å evaluere effekten av disse variable på hastigheten av celledeling. Nøkkelen assay for denne aktiviteten er bestemmelse av cellenes levedyktighet, som bare krever celletelling, ved hjelp av én av to metoder. Hver metode avhenger av sterke mikros ferdigheter. Elevene bestemme cellenes levedyktighet ved anvendelse av en standard, hemocytometer fremgangsmåte og en ny fremgangsmåte og photomicroscopy foreslå. Basert på sine funn, kan de foreslå og teste endringer i aktiviteten. Studenter deretter representere sine data og tolke resultatene å avgrense hypotese og tenke ut nye eksperimentelle strategier.
Dette laboratoriet aktiviteten er egnet for freshman eller sophomore nivå studenter hovedfag i de biologiske vitenskaper. Det er kondensert til en ukes lab-modul som kan gjennomføres i en første året, generell biologi eller andre året, mobil / molekylærbiologi kurset. Ferdighetene som trengs for forsvarlig gjennomføring av aktiviteten omfatter grunnleggende aritmetikk og algebra, fortrolighet med en rekke cmalm laboratorie ferdigheter (f.eks, pipettering, løsning making, steril teknikk), dataanalyse, enkel lysmikroskopi og tidsstyring, sammen med instruktør kunnskap om cellekultur og regnearkprogrammer. Reagenser som kreves inkluderer en dyrecellelinje modell for kreft (for eksempel musebrysttumorceller, MMT 2), kjemoterapi (for eksempel tamoxifen, curcumin, metformin, og aspirin), trypanblått og celledyrkningsmedier (f.eks Eagles Minimum Essential Medium ; EMEM) med riktig kosttilskudd (f.eks donor hest og fosterets storfe serum). Virkemidler som trengs inkluderer en omvendt lysmikroskop med digitalkamera vedlegg, datamaskin, 100 mm og 24 brønners vevskulturplater, CO 2 inkubator (eller tilsvarende), biosikkerhet kabinett (BSC, klasse II), hemocytometer og digital mikros programvare.
Det finnes gode eksempler på konkrete lab aktiviteter som er avhengige av dyr cellekultur til Teach lavere grads studenter om begreper i cellebiologi tre. Men mange trenger forsyninger eller teknikker som ikke er lett tilgjengelig (for eksempel radioaktive isotoper, levende dyr vev, avansert bildebehandling utstyr 1,4,5), beskriver protokoller som er ganske avansert (f.eks egnet for en 400-nivå kurs 6), eller krever multi-uke eller semester lange prosjekter 6,7. Laboratoriet aktivitet er beskrevet her er enkel og kan gjennomføres i en enkelt uke med vanlig laboratorieutstyr.
Oppsummert denne lab modulen effektivt introduserer eller forsterker begrepene cellesyklus, cellulære signalveier og kreft samtidig som du lærer grunnleggende og avanserte lab ferdigheter, eksperimentell dataanalyse, metode for dyr cellekultur og den vitenskapelige prosessen. Laboratoriet modulen er enkel og økonomisk tilgjengelig og gir både fleksibilitet og mulighet for åpent spørsmål. Aktiviteten oppfordrer student kreativitetved å tilveiebringe en mal eksperimentell strategi som fungerer som en veiledning, men ikke en oppskrift. Viktigst, aktivitetstilfredsstiller alle lærings domener av Blooms taksonomi 8 som det krever å huske, forstå, bruke, analysere, vurdere og skape ved å engasjere elevene i en prosess som trekker dem ut av læreboken og inn i verden av vitenskapelig forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
En lab-modul blir presentert som tar sikte på å lære en rekke emner i cellebiologi gjennom avanserte teknikker av animalsk cellekultur. Modulen oppnår dette ved å analysere virkningene av en rekke anti-proliferative kjemikalier på replikasjonen av celler som modellerer human brystkreft. Den primære analysen er avhengig av den grunnleggende teknikken for celletelling, og introduserer en ny måte å telle celler ved hjelp av mikroskopi programvare. Aktivitetene omfatter modulen kan utføres med instrumenter og utst…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work is supported by the Joseph Alexander Foundation, the ASBMB Undergraduate Research Award, 2013-2014, and a Science Award Grant, Marymount Manhattan College, 2012-2013.
Materials
| Tissue Culture Hood | ESCO Labculture Reliant | Class II Type A2 Biological Safety Cabinet | |
| Waterjactor CO2 Incubator | CEDCO | Model 1510 | |
| Bright-line Hemocytometer | American Optical | with two separate grids | |
| Motic Images Plus | Mac OSX Verison 2.0 or higher | ||
| Gilson Pipetman | Rainin instrument co. inc | P-20D, P-200D, P-1000D | |
| CK30/CK40 Culture Microscope | Olympus | 4 objective inverted light microscope with camera | |
| 200 uL Pipet tips | MidSci | 40200C | |
| 1000 uL Pipet tips | MidSci | AVR4 | |
| 10 mL Seriological Pipets | TPP | TP94010 | |
| 24-well plates | CoStar- Tissue Culture Cluster | 3524 | 24 wells, 16 mm well diameter, Radiation sterilized |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Sigma | T8154 | 100 mL, cell culture tested non-haz |
| Bright-line Hemacytometer replacement coverslip, non-haz | Sigma | Z375357 | |
| Mouse Mammary Tumor(MMT) cells | ATCC | CCL-51 | |
| Eagle Minimum Essentail Medium (EMEM) | ATCC | 30-2003 | 500 mL |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | F0926 | 500 mL |
| Meformin Hydrochloride | Sigma | PHR1084 | 500 mg |
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | white or white-yellow powder |
| Curmumin | Sigma | C1386 | yellow-orange powder |
| Aspirin | Sigma | A2093 | meets USP testing specifications |
References
- Hammamieh, R., et al. Students investigating the antiproliferative effects of synthesized drugs on mouse mammary tumor cells. Cell Biol Educ. 4 (3), 221-234 (2005).
- Sykes, J. A., Whitescarver, J., Briggs, L. Observations on a cell line producing mammary tumor virus. J Natl Cancer Inst. 41 (6), 1315-1327 (1968).
- Palombi, P. S. J., Snell, K. Learning about Cells as Dynamic Entities: An Inquiry-Driven Cell Culture Project. Bioscene: Journal of College Biology Teaching. 33, 27-33 (2008).
- Ledbetter, M. L. S., Lippert, M. J. Glucose Transport in Cultured Animal Cells: An Exercise for the Undergraduate Cell Biology Laboratory. Cell Biology Education. 1 (3), 76-86 (2002).
- Weaver, D. Cardiac Cells Beating in Culture: A Laboratory Exercise. American Biology Teacher. 69, 407-410 (2007).
- Marion, R. E., Gardner, G. E., Parks, L. D. Multiweek cell culture project for use in upper-level biology laboratories. Advances in Physiology Education. 36, 154-157 (2012).
- Mozdziak, P. E. P., James, N., Carson, S. u. s. a. n. D. An Introductory Undergraduate Course Covering Animal Cell Culture Techniques. Biochemistry and Molecular Biology Education. 32 (5), 319-322 (2004).
- Anderson, L. W., et al. . A taxonomy for learning, teaching and assessing: A revision of Bloom’s Taxonomy of educational objectives (Complete Edition). , (2001).
- Centers for Disease Contol and Prevention. . Appendix A – Primary Containment for Biohazards: Selection, Installation and Use of Biological Safety Cabinets. , (2014).
- Davis, J. M. . Basic Cell Culture: A Practical Approach. , (2002).
- Algra, A. M., Rothwell, P. M. Effects of regular aspirin on long-term cancer incidence and metastasis: a systematic comparison of evidence from observational studies versus randomised trials. Lancet Oncol. 13 (5), 518-527 (2012).
- Anand, P., Sundaram, C., Jhurani, S., Kunnumakkara, A. B., Aggarwal, B. B. Curcumin and cancer: an ‘old-age’ disease with an ‘age-old’ solution. Cancer Lett. 267 (1), 133-164 (2008).
- Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Mechanisms behind the aspirin use and decreased breast cancer incidence. J BUON. 16 (1), 180 (2011).
- Ararat, E., Sahin, I., Altundag, K. Aspirin intake may prevent metastasis in patients with triple-negative breast cancer. Med Oncol. 28 (4), 1308-1310 (2011).
- Blandino, G., et al. Metformin elicits anticancer effects through the sequential modulation of DICER and c-MYC. Nat Commun. 3, 865 (2012).
- Kunnumakkara, A. B., Anand, P., Aggarwal, B. B. Curcumin inhibits proliferation, invasion, angiogenesis and metastasis of different cancers through interaction with multiple cell signaling proteins. Cancer Lett. 269 (2), 199-225 (2008).
- Burstein, D. E., Blumberg, P. M., Greene, L. A. Nerve growth factor-induced neuronal differentiation of PC12 pheochromocytoma cells: lack of inhibition by a tumor promoter. Brain Res. 247 (1), 115-119 (1982).
- Nazarali, S. A., Narod, S. A. Tamoxifen for women at high risk of breast cancer. Breast Cancer (Dove Med Press). 6, 29-36 (2014).
- Cui, J., et al. Cross-talk between HER2 and MED1 regulates tamoxifen resistance of human breast cancer cells). Cancer Res. 72 (21), 5625-5634 (2012).
- Komm, B. S., Mirkin, S. An overview of current and emerging SERMs. J Steroid Biochem Mol Biol. 143C, 207-222 (2014).
- Kaplan, R. M., Satterfield, J. M., Kington, R. S. Building a better physician–the case for the new MCAT. N Engl J Med. 366 (14), 1265-1268 (2012).
