Detectie van miRNA Doelen in High-throughput Met de 3'LIFE Assay
Summary
Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.
Abstract
Lichtgevende Identificatie van functionele elementen in 3'UTRs (3'LIFE) kan de snelle identificatie van doelwitten van specifieke miRNAs in een reeks van honderden bevraagd 3'UTRs. Target identificatie is gebaseerd op de dual-luciferase assay, die detecteert binding bij het mRNA niveau door meting translationele uitgang, die een functionele uitlezing van miRNA richten. 3'LIFE maakt gebruik van niet-merkgebonden buffers en reagentia, en publiekelijk beschikbare verslaggever bibliotheken, waardoor genoom-brede schermen haalbaar en rendabel. 3'LIFE kan worden uitgevoerd in een standaard lab instelling of opgeschaald met behulp van vloeibare handling robots en andere high-throughput instrumentatie. We illustreren de benadering met behulp van een dataset van menselijke 3'UTRs gekloond in 96-well platen en twee test-miRNAs, laat-7c en miR-10b. We demonstreren hoe DNA bereiding, transfectie, celcultuur en luciferase assays in 96 putjes format uit te voeren en zorgen voor gegevensanalyseanalyse. Tot slot 3'LIFE is zeer reproduceerbare, snelle, systematische, en identificeert groot vertrouwen doelen.
Introduction
Het algemene doel van deze methode is voor het opsporen en nauwkeurig microRNA (miRNA) doelen in kaart in high-throughput. MiRNAs endogene niet-coderende RNA's ~ 22 nucleotiden lang. Na transcriptie en verwerking, zijn volwassen miRNAs opgenomen in een eiwitcomplex genaamd de RNA-geïnduceerde silencing complex (RISC). Elk miRNA begeleidt de RISC elementen voornamelijk gevestigd zijn in de 3 'onvertaalde regio (3'UTRs) van messenger RNA (mRNA) te richten, wat resulteert in een van beide vertalingen repressie of mRNA splitsing 1. Mirna herkennen doelplaatsen op basis van standaard Watson-Crick en G: U wiebelen baseparing en zijn ontaard in de natuur, met meerdere mismatched basenparen en puilden regio. Veel miRNAs zijn in grote lijnen behouden van planten op de mens 2,3, waar ze spelen een breed scala van biologische rollen. In metazoa kan miRNAs meerdere biologische processen zoals mobiele beslissingen over het lot 4, ontwikkelingsstoornissen timing 5 beïnvloeden </sup>, En vertonen vaak weefsel specifieke expressie patronen 6,7. MiRNA misexpression kan ook leiden tot afwijkende genregulatie, die grote invloed op celgedrag uitsluitend gebaseerd op de functie van doelgenen hebben. Als zodanig zijn miRNAs gekoppeld aan een groot aantal ziekten, waaronder neurodegeneratie 8,9, diabetes en kanker 10 11. Bioinformatic en natte bank benaderingen suggereert dat elke miRNA kan in staat targeting honderden tot duizenden verschillende mRNAs 14/12, wat aangeeft dat high-throughput of genoom benaderingen moeten deze grote groep potentiële interacties sonde.
Het identificeren van target genen is een cruciaal onderdeel van mechanistisch definiëren miRNA functie, en om dat te doen onderzoekers moeten in staat zijn om doelen te onthullen op een grote schaal. Verschillende benaderingen zijn ontwikkeld om miRNA doelen, waaronder bioinformatic voorspelling algoritmes identificeren, high-throughput sequentiebepalinggerichte mRNAs en reporter gebaseerde assays. Elk van deze benaderingen heeft inherent sterke en zwakke punten. Aangezien targeting miRNA wordt geleid door sequentiespecificiteit, met name van 2-6 nucleotiden van het miRNA (genoemd het zaad regio), diverse algoritmen ontwikkeld om miRNA targets gehele genoom van veel organismen te voorspellen. Deze algoritmen zijn ontwikkeld op basis van de waargenomen baseparing motieven van gevalideerde miRNA targets, en vaak gebruik parameters zoals stringente zaad koppelen behoud plaats en / of thermodynamische stabiliteit 15. Hoewel deze filters te verfijnen het grote aantal vermeende doelwitten met voldoende complementariteit om alleen hoge vertrouwen targets, kunnen zij worden uitgesloten soorten specifieke en niet-canonieke miRNA doelwit sites, die recent bewijs suggereert zijn wijdverspreid 16-24. Bovendien hoeven deze voorspellingen geen rekening mechanismen van mRNA verwerking die miRNA doelplaatsen, zoals alternatieve polyadenylatie sluiten25, RNA editing 26, RNA methylatie 27 en coöperatieve binding. Als zodanig, hebben hoge vals-positieve en vals-negatieve tarieven gemeld voor vele algoritmen 22,24,28. Hoewel deze algoritmes zijn nuttig om kandidaat miRNA targets te identificeren voor de volgende experimentele validatie, deze hoge foutenpercentages beperken de effectiviteit van bioinformatica methoden voor systematische miRNA doeldetectie.
Om systematisch sonde voor interacties tussen een bepaalde miRNA en potentieel doelwit 3'UTRs hebben we een high-throughput assay genoemd Lichtgevende Identificatie van functionele elementen in 3'UTRs (3'LIFE) 24 ontwikkeld. Deze test meet de directe interacties en translationele onderdrukking van de test 3'UTR van een query miRNA met een dual luciferase reporter systeem. In dit systeem zijn de 3'UTR van een gen van belang wordt gekloneerd stroomafwaarts van het luciferase (Fluc) reporter leesraam vuurvlieg. De verslaggever nadelentruct wordt gecotransfecteerd met een query miRNA in HEK293T cellen. MiRNA targeting wordt bepaald door de relatieve verandering tussen de test fluctuaties :: 3'UTR reporter en een tweede niet-specifieke Renilla luciferase reporter. Belangrijk luciferase assays detecteren functionele miRNA / mRNA interacties die de translationele uitgang van de reporter beïnvloeden. Dit is een belangrijk voordeel ten opzichte van traditionele methoden miRNA regelgeving, zoals RT-qPCR en Western blots te detecteren, doordat deze omzeilt verschillen in mRNA degradatie en translationele repressie, evenals veranderingen in eiwitgehalte onafhankelijk van 3'UTR based regulation.
Luciferase assays worden algemeen gebruikt voor directe miRNA targets valideren vanwege hun relatieve eenvoud en gevoeligheid, maar hun gebruik in high-throughput screens wordt beperkt door de hoge kosten van de verbruikbare reagentia, het ontbreken van 3'UTR bibliotheken uit openbare bronnen, en het ontbreken gestandaardiseerde luciferase protocols, wat leidt tot moeilijkheden bij het vergelijken van functionele repressie over meerdere datasets. Om het gebruik van de 3'LIFE test te vergemakkelijken, hebben we de nadruk gelegd op de vereenvoudiging van de experimentele opzet, het gebruik van niet-commerciële transfectie 24 en luciferase reagentia 29, het creëren van een 3'UTR bibliotheek die regelmatig wordt bijgewerkt en uitgebreid, en is beschikbaar via een openbare plasmide repository 30.
De schaalbaarheid van de 3'LIFE assay maakt het screenen van een grote bibliotheek 3'UTR voor het richten van een bepaalde miRNA zonder voorspannen van het scherm richting bioinformatically geïdentificeerde genen. Naast het testen canonieke en voorspelde interacties, deze systematische aanpak maakt de identificatie van nieuwe targets aangedreven via niet-canonieke en / of species-specifieke interacties. Belangrijk is dat het effect van miRNA gericht op eiwitproductie algemeen verstaan te resulteren in bescheiden translationele repressie 15,31 </ Sup>, wat suggereert dat een primaire rol van miRNA regelgeving is te fine-tunen eiwit-uitgang, bescherming tegen afwijkende niveaus van genexpressie, en zorgen voor robuustheid aan specifieke programma's 32,33 cel. De gevoeligheid van de luciferase assay combinatie met de inherente aantal negatieve miRNA / mRNA interacties in het 3'LIFE scherm kan de detectie van subtiele effecten van miRNA gericht op een groot aantal genen en de identificatie van verschillende componenten van gen netwerken worden geregeld door een bepaalde miRNA 24.
Hier beschrijven we de 3'LIFE protocol, en tonen het is haalbaar door het screenen van twee goed gekarakteriseerde miRNAs, miR-10b en laat-7c tegen een panel van 275 menselijke 3'UTRs (figuur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
De 3'LIFE test identificeert functionele miRNA doelen in 3'UTRs in high-throughput. Deze test is bruikbaar voor onderzoekers die experimenteel identificeren van een groot aantal mogelijke doelwitten voor de miRNA plaats. De 3'LIFE assay is een krachtige benadering moet worden gezocht naar 3'UTR gedreven regulering, dat de test verschaft een maat voor de functionele miRNA targeting, en de binaire testen van een reporter :: 3'UTR tegen een enkele miRNA kan vertrouwen richten de targeting status van de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.
Materials
| Reagents | ||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 |
| EGTA | Sigma | E3889 |
| ATP | Sigma | FLAAS |
| DTT | Sigma | D0632 |
| MgSO4 | Sigma | M7506 |
| CoA | Sigma | C4282 |
| luciferin | Sigma | L9504 |
| NaCl | Sigma | S7653 |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 |
| BSA | Sigma | A2153 |
| NaN3 | Sigma | S2002 |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| FBS | Sigma | F2442 |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 |
| Trypsin | T2600000 | |
| Consumables | ||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 |
| Instruments | ||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).
- Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Wienholds, E., et al. MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science. 309 (5732), 310-311 (2005).
- Darnell, D. K., et al. MicroRNA expression during chick embryo development. Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).
- Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. RNA and microRNAs in fragile X mental retardation. Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).
- Kim, J., et al. A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons. Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).
- Poy, M. N., et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Paraskevopoulou, M. D., et al. DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows. Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).
- Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3’UTR. Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).
- Lal, A., et al. miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to ‘seedless’ 3’UTR microRNA recognition elements. Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).
- Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).
- Shin, C., et al. Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing. Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).
- Azzouzi, I., et al. MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis. PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).
- Chen, J., et al. miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma. Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).
- Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. An alternative mode of microRNA target recognition. Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).
- Jiao, L. R., et al. MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors. PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).
- Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. 3’LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput. Nucleic Acids Res. , (2014).
- Mangone, M., et al. The landscape of C. elegans 3’UTRs. Science. 329 (5990), 432-435 (2010).
- Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development. Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation. Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Zhou, P., et al. Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3’UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs. Plos One. 8 (7), e68204 (2013).
- Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis. Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).
- Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes. Cell. 149 (3), 515-524 (2012).
- Pelaez, N., Carthew, R. W. Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective. Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).
