זיהוי של מטרות מירנה בתפוקה גבוהה באמצעות assay 3'LIFE
Summary
Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.
Abstract
פלורסנט זיהוי של אלמנטים פונקציונליים ב3'UTRs (3'LIFE) מאפשר זיהוי המהיר של מטרות של miRNAs הספציפי בתוך מערך של מאות 3'UTRs שאילתא. זיהוי יעד מבוסס על assay הכפול לוציפראז, אשר מזהה מחייב ברמת ה- mRNA על ידי מדידת תפוקת translational, נותנת קריאת נתונים פונקציונליות של מירנה מיקוד. 3'LIFE משתמש מאגרים שאינן קניינית וריאגנטים, וספריות כתב זמינות בפומבי, מה שהופך את מסכי הגנום אפשרי וחסכוני. ניתן לבצע 3'LIFE או במעבדה הגדרה סטנדרטית או לשנותם באמצעות רובוטים טיפול נוזליים ומכשור תפוקה גבוהה אחר. אנו מדגימים את הגישה באמצעות בסיס הנתונים של 3'UTRs האנושי משובט ב96-גם צלחות, ושני miRNAs בדיקה, לתת-7C וmiR-10b. אנו מדגימים כיצד לבצע הכנת DNA, transfection, תרבות תא ומבחני בלוציפראז בפורמט 96-היטב, ולספק כלים לנתוניםניתוח. לסיכום 3'LIFE הוא מאוד לשחזור, מהיר, שיטתי, ומזהה מטרות ביטחון גבוהות.
Introduction
המטרה הכוללת של שיטה זו היא לזהות ולמפות בדיוק microRNA מטרות (מירנה) בתפוקה גבוהה. MiRNAs הוא RNAs קידוד שאינו אנדוגני ~ 22 נוקלאוטידים באורך. בעקבות שעתוק ועיבוד, miRNAs הבוגר משולבים בקומפלקס חלבון הנקרא RNA מושרה השתקה מורכב (RISC). כל מירנה מנחה את RISC למקד אלמנטים הממוקמים בעיקר באזורי 3'untranslated (3'UTRs) של RNAs שליח (mRNAs), וכתוצאה מכך גם דיכוי תרגום או מחשוף mRNA 1. מירנה להכיר אתרי יעד המבוססים על ווטסון-קריק הסטנדרטי וG: U לנענע זיווג בסיס, והם מנוונים בטבע, המכיל זוגות בסיסים תואמים מרובים ובלטה אזורים. miRNAs רבים נשמר באופן רחב מצמחים לבני האדם 2,3, שבו הם משחקים במגוון רחב של תפקידים ביולוגיים. בmetazoans miRNAs יכול להשפיע על תהליכים ביולוגיים רבים, כולל החלטות גורל תא 4, עיתוי התפתחותי 5 </sup>, ולעתים קרובות מפגין דפוסי ביטוי רקמות ספציפיים 6,7. misexpression מירנה יכול גם לגרום לויסות הגנים חריגה, אשר יכולה להיות השפעה מהותית על מבוססת אך ורק על התפקוד של גני מטרת התנהגות תא. ככזה, miRNAs צמוד למגוון רחב של מחלות, כולל ניוון מוחיים 8,9, סוכרת וסרטן 10 11. Bioinformatic וגישות רטוב ספסל מצביעים על כך שכל מירנה עשויה להיות מסוגל מיקוד מאות עד אלפי mRNAs הברור 12-14, מצביע על כך שתפוקה גבוהה או הגנום גישות רחבות נדרשות לחקור בריכה גדולה זו של אינטראקציות פוטנציאליות.
זיהוי גני המטרה הוא מרכיב קריטי בתפקוד מירנה מכניסטי הגדרה, וכדי לעשות זאת חוקרים חייבים להיות מסוגלים לחשוף מטרות בקנה מידה גדולה. כמה גישות פותחו כדי לזהות מטרות מירנה, כולל אלגוריתמי תחזית bioinformatic, רצף תפוקה גבוההשל ממוקד mRNAs, וכתב מבחני מבוסס. כל הגישות הללו עוצמות וחולשות הגלומות. בהתחשב בכך שמיקוד מירנה מונחה על ידי סגוליות רצף, בעיקר של נוקלאוטידים 2-6 של מירנה (שמכונה אזור הזרע), כמה אלגוריתמים פותחו לחזות מטרות מירנה לאורך הגנום של אורגניזמים רבים. אלגוריתמים אלה מאומנים באמצעות המוטיבים בסיס שיוך הנצפים של מטרות מירנה תוקף, ולעתים קרובות לנצל פרמטרים כגון זיווג מחמיר זרע, שימור אתר, ו / או יציבות התרמודינמית 15. בעוד מסננים אלה לחדד מספר רב של מטרות המשוערות עם השלמה מספיק למטרות ביטחון בלבד גבוהות, הם עלולים שלא לכלול מיני אתרים ספציפיים ואינם קנוני מירנה יעד, שהראיות האחרונות עולה נפוצות 16-24. יתר על כן, תחזיות אלו אינן לוקחות בחשבון את מנגנוני עיבוד mRNA שלא לכלול אתרי יעד מירנה, כגון polyadenylation החלופי25, עריכת RNA 26, מתילציה RNA 27, ומחייב שיתוף פעולה. ככזה, שיעורים חיוביים ושקר שקר שליליים גבוהים דווחו לאלגוריתמים רבים 22,24,28. בעוד אלגוריתמים אלה הם שימושיים כדי לזהות מטרות מירנה מועמד לאימות ניסיוני שלאחר מכן, שיעורי שגיאה הגבוהים אלה מגבילים את היעילות של גישות bioinformatic לאיתור יעד מירנה שיטתית.
לחקור באופן שיטתי לאינטראקציות בין מירנה נתון ו3'UTRs פוטנציאלי הממוקד פיתחנו assay תפוקה גבוהה נקרא פלורסנט זיהוי של אלמנטים פונקציונליים ב3'UTRs (3'LIFE) 24. צעדים זה assay אינטראקציות ישירות ודיכוי translational של 3'UTR הבדיקה על ידי שאילתא מירנה באמצעות מערכת כתב בלוציפראז כפולה. במערכת זו, 3'UTR של גן של עניין הוא משובט במורד הזרם של מסגרת קריאת גחלילית בלוציפראז (fluc) כתב. חסרונות הכתבtruct הוא cotransfected עם שאילתא מירנה בתאי HEK293T. מיקוד מירנה נקבע על ידי מדידת השינוי ביחס בין fluc המבחן :: כתב 3'UTR וכתב בלוציפראז Renilla אינו ספציפי שני. חשוב לציין, מבחני בלוציפראז לזהות אינטראקציות מירנה / mRNA תפקודיים המשפיעות על תפוקת translational של הכתב. זהו יתרון מרכזי על פני שיטות מסורתיות כדי לזהות רגולציה מירנה, כגון RT-qPCR וכתמים מערביים, שבזו עוקפת הבדלים בשפלת mRNA ודיכוי translational, כמו גם שינויים בשפע חלבון עצמאי של רגולציה מבוססת 3'UTR.
מבחני בלוציפראז משמשים באופן נרחב כדי לאמת מטרות מירנה ישירות בגלל פשטותם היחסית וברגישות, עדיין השימוש בם במסכי תפוקה גבוהה הוא מוגבל על ידי עלויות גבוהות כרוכות בחומרים כימיים מתכלים, חוסר ספריות 3'UTR ממקורות ציבוריים, והעדר של prot לוציפראז הסטנדרטיocols, שהוביל לקשיים בהשוואת דיכוי פונקציונלי על פני מערכי נתונים מרובים. כדי להקל על השימוש של assay 3'LIFE, יש לנו דגש על פישוט של עיצוב ניסיוני, שימוש בחומרים כימי transfection 24 ולוציפראז לא מסחרי 29, יצירת ספריית 3'UTR המתעדכנת באופן קבוע ומורחבת, והוא זמין ב מאגר פלסמיד ציבור 30.
יכולת הרחבה של assay 3'LIFE מאפשרת הקרנה של ספריית 3'UTR גדולה למיקוד על ידי מירנה ניתנת ללא הטיית המסך לכיוון הגנים שזוהו bioinformatically. בנוסף לבדיקת אינטראקציות הקנונית וחזו, גישה שיטתית זו מאפשרת זיהוי מטרות רומן מונעות באמצעות אינטראקציות הלא-הקנונים ו / או מינים ספציפיות. חשוב לציין, את ההשפעה של מירנה מיקוד על ייצור חלבון הוא הבין בדרך כלל לגרום לדיכוי translational הצנוע 15,31 </ Sup>, המצביע על כך תפקיד עיקרי של הרגולציה מירנה הוא לכוונן תפוקת חלבון, להגן מפני רמות חריגות של ביטוי גנים, ומספק חוסן לתא תוכניות ספציפיות 32,33. הרגישות של assay בלוציפראז בשילוב עם המספר הגדול מיסודו של אינטראקציות מירנה / mRNA שליליים במסך 3'LIFE מאפשרת זיהוי של השפעות עדינות של מירנה מיקוד על מספר גדול של גנים, וזיהוי של מרכיבים רבים של רשתות גנים ש מוסדרים על ידי מירנה נתנה 24.
כאן אנו מתארים את פרוטוקול 3'LIFE, ולהפגין זה היתכנות על ידי הקרנת שני miRNAs המאופיין היטב, miR-10b ולתת-7C נגד פנל של 275 3'UTRs האנושי (איור 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Assay 3'LIFE מזהה מטרות מירנה תפקודיות ב3'UTRs בתפוקה גבוהה. assay זה שימושי לחוקרים המבקשים לזהות באופן ניסיוני במספר רב של מטרות המשוערות למירנה עניין שלהם. Assay 3'LIFE הוא גישה רבת עוצמה לשאילתא לרגולציה מונעת 3'UTR, שבassay מספק מדד תפקודי של מיקוד מירנה, והבדיקות בינארי של ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.
Materials
| Reagents | ||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 |
| EGTA | Sigma | E3889 |
| ATP | Sigma | FLAAS |
| DTT | Sigma | D0632 |
| MgSO4 | Sigma | M7506 |
| CoA | Sigma | C4282 |
| luciferin | Sigma | L9504 |
| NaCl | Sigma | S7653 |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 |
| BSA | Sigma | A2153 |
| NaN3 | Sigma | S2002 |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| FBS | Sigma | F2442 |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 |
| Trypsin | T2600000 | |
| Consumables | ||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 |
| Instruments | ||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).
- Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Wienholds, E., et al. MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science. 309 (5732), 310-311 (2005).
- Darnell, D. K., et al. MicroRNA expression during chick embryo development. Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).
- Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. RNA and microRNAs in fragile X mental retardation. Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).
- Kim, J., et al. A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons. Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).
- Poy, M. N., et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Paraskevopoulou, M. D., et al. DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows. Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).
- Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3’UTR. Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).
- Lal, A., et al. miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to ‘seedless’ 3’UTR microRNA recognition elements. Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).
- Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).
- Shin, C., et al. Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing. Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).
- Azzouzi, I., et al. MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis. PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).
- Chen, J., et al. miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma. Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).
- Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. An alternative mode of microRNA target recognition. Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).
- Jiao, L. R., et al. MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors. PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).
- Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. 3’LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput. Nucleic Acids Res. , (2014).
- Mangone, M., et al. The landscape of C. elegans 3’UTRs. Science. 329 (5990), 432-435 (2010).
- Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development. Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation. Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Zhou, P., et al. Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3’UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs. Plos One. 8 (7), e68204 (2013).
- Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis. Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).
- Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes. Cell. 149 (3), 515-524 (2012).
- Pelaez, N., Carthew, R. W. Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective. Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).
