La detección de los genes miARN objetivos en de alto rendimiento utilizando el ensayo 3'LIFE
Summary
Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.
Abstract
Luminiscentes Identificación de elementos funcionales en 3'UTRs (3'LIFE) permite la rápida identificación de los objetivos de miRNAs específicos dentro de una matriz de cientos de 3'UTRs consultados. La identificación del objetivo se basa en el ensayo de luciferasa dual, que detecta la unión a nivel de mRNA mediante la medición de la salida de la traducción, dando una lectura funcional de los genes miARN focalización. 3'LIFE utiliza buffers no propietarios y reactivos, y bibliotecas reportero públicamente disponibles, por lo que las pantallas de todo el genoma viable y rentable. 3'LIFE se puede realizar en un laboratorio estándar o ampliarse el uso de robots de manipulación de líquidos y otros instrumentos de alto rendimiento. Se ilustra el método utilizando un conjunto de datos de 3'UTRs humanos clonados en placas de 96 pocillos, y dos miRNAs prueba, vamos-7c y miR-10b. Demostramos cómo realizar la preparación de ADN, transfección, cultivo celular y ensayos de luciferasa en formato de 96 pocillos, y proporcionar herramientas para datosanálisis. En conclusión 3'LIFE es altamente reproducible, rápido, sistemático, e identifica objetivos de alta confianza.
Introduction
El objetivo general de este método consiste en detectar y mapear precisamente microARN (miARN objetivos) en alto rendimiento. MiRNAs son endógenos ARN no codificantes ~ 22 nucleótidos de longitud. Después de la transcripción y el procesamiento, miRNAs maduros se incorporan en un complejo de proteína llamada el silenciamiento de ARN inducida complejo (RISC). Cada miRNA guía el RISC a elementos situados principalmente en las regiones 3 'no traducida (3'UTRs) de los ARN mensajeros (ARNm) diana, lo que resulta en cualquiera de traducción represión o mRNA división 1. Mirna reconocer sitios diana, según norma Watson-Crick y G: U wobble base de sincronización, y son degenerados en la naturaleza, que contiene varios pares de bases coincidentes y las regiones se hinchó. Muchos miRNAs son ampliamente conservadas de las plantas a los seres humanos 2,3, donde juegan una amplia gama de funciones biológicas. En metazoos miRNAs pueden influir múltiples procesos biológicos incluyendo las decisiones del destino celular 4, el calendario de desarrollo 5 </sup>, Y con frecuencia exhiben patrones de expresión específicos de tejido 6,7. MIRNA misexpression también puede resultar en la regulación génica aberrante, que puede tener una influencia sustancial en el comportamiento celular basada únicamente en la función de los genes diana. Como tal, miRNAs están vinculados a una amplia gama de enfermedades, incluyendo neurodegeneración 8,9, diabetes y cáncer 10 11. Bioinformática y enfoques húmedo banco sugieren que cada miARN puede ser capaz de apuntar a cientos de miles de ARNm distintos 12-14, lo que indica que se requieren enfoques sectoriales de alto rendimiento o del genoma para investigar este gran número de interacciones potenciales.
La identificación de genes diana es un componente crítico de la definición de la función mecánica miARN, y hacer lo que los investigadores deben ser capaces de revelar los objetivos a gran escala. Se han desarrollado varios enfoques para identificar los genes miARN objetivos, incluyendo los algoritmos de predicción bioinformáticas, secuenciación de alto rendimientodel objetivo ARNm, y el reportero ensayos basa. Cada uno de estos enfoques tiene fortalezas y debilidades inherentes. Dado que los genes miARN focalización es guiado por la especificidad de secuencia, más notablemente de los nucleótidos 2-6 de la miARN (denominada la región de la semilla), varios algoritmos se han desarrollado para predecir los genes miARN objetivos en todo el genoma de muchos organismos. Estos algoritmos son capacitados utilizando los observados motivos de apareamiento de bases de los genes miARN objetivos validados, y con frecuencia utilizan parámetros como la vinculación estricta de semillas, la conservación de sitios y / o estabilidad termodinámica 15. Si bien estos filtros refinan el gran número de supuestos objetivos con suficiente complementariedad con los objetivos de confianza solamente altas, pueden excluir especies sitios específicos y no canónicos miARN objetivo, que la evidencia reciente sugiere se han generalizado 16-24. Por otra parte, estas predicciones no tienen en cuenta los mecanismos de procesamiento de ARNm que excluyen a los sitios objetivo miARN, como alternativa polyadenylation25, 26 edición de ARN, el ARN metilación 27 y unión cooperativa. Como tal, las altas tasas de falsos negativos y falsos positivos han sido reportados para muchos algoritmos 22,24,28. Mientras que estos algoritmos son útiles para identificar candidatos miARN objetivos para la validación experimental posterior, estas altas tasas de error limitar la eficacia de los enfoques bioinformáticas para la detección sistemática miARN.
Para investigar sistemáticamente la interacción entre un miARN dado y 3'UTRs potencialmente dirigidas hemos desarrollado un ensayo de alto rendimiento llamado luminiscentes Identificación de elementos funcionales en 3'UTRs (3'LIFE) 24. Este ensayo mide las interacciones directas y la represión de traslación de la 3'UTR de prueba por una consulta miARN usando un sistema indicador de luciferasa dual. En este sistema, el 3'UTR de un gen de interés se clona aguas abajo de la luciferasa (Fluc) reportero marco de lectura luciérnaga. Los contras reporterotruct se cotransfecta con una consulta miRNA en células HEK293T. Mirna focalización se determina midiendo la variación relativa entre el Fluc prueba :: reportero 3'UTR y un segundo reportero no específica luciferasa Renilla. Es importante destacar que los ensayos de luciferasa detectan interacciones funcionales miARN / mRNA que influyen en la salida de traslación de la periodista. Esta es una ventaja clave sobre los métodos tradicionales para detectar la regulación de los genes miARN, tales como RT-qPCR y transferencias de Western, en que esta pasa por diferencias en la degradación del ARNm y la represión de traducción, así como los cambios en la abundancia de proteína independiente de la regulación basada 3'UTR.
Los ensayos de luciferasa son ampliamente utilizados para validar blancos directos miARN debido a su sencillez y sensibilidad relativa, sin embargo, su uso en pantallas de alto rendimiento está limitado por los altos costos asociados con reactivos consumibles, la falta de bibliotecas 3'UTR de fuentes públicas, y la ausencia de prot luciferasa normalizadaPROTOCOLOS, dando lugar a dificultades en la comparación de la represión funcional a través de múltiples conjuntos de datos. Para facilitar el uso del ensayo 3'LIFE, hemos puesto énfasis en la simplificación del diseño experimental, la utilización de la transfección 24 y luciferasa reactivos no comerciales 29, la creación de una biblioteca 3'UTR que se actualiza periódicamente y se expandió, y está disponible a través de un repositorio público plásmido 30.
La escalabilidad del ensayo 3'LIFE permite la detección de una gran biblioteca 3'UTR para la orientación por un miARN dado sin sesgar la pantalla hacia genes bioinformatically identificados. Además de probar las interacciones canónicas y previstos, este enfoque sistemático permite la identificación de nuevas dianas impulsadas a través de interacciones no canónicos y / o específicos de las especies. Es importante destacar que el efecto de los genes miARN la orientación en la producción de proteína se entiende generalmente para dar lugar a la represión de traducción modesto 15,31 </ Sup>, lo que sugiere que un papel primordial de la regulación miARN es para poner a punto la producción de proteínas, la protección contra los niveles aberrantes de expresión génica, y proporcionar robustez a la celda programas específicos 32,33. La sensibilidad del ensayo de luciferasa se combina con el inherentemente gran número de interacciones negativas miARN / mRNA en la pantalla 3'LIFE permite la detección de los efectos sutiles de miARN focalización en un gran número de genes, y la identificación de múltiples componentes de las redes de genes que están regulados por un determinado miARN 24.
Aquí se describe el protocolo 3'LIFE, y demostrar que es de viabilidad mediante el cribado de dos miRNAs bien caracterizados, miR-10b y let-7c contra un panel de 275 3'UTRs humanos (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
El ensayo 3'LIFE identifica los genes miARN objetivos funcionales en 3'UTRs en alto rendimiento. Este ensayo es útil para los investigadores que desean identificar experimentalmente un gran número de supuestos objetivos para su miARN de interés. El ensayo 3'LIFE es un enfoque poderoso para consultar para la regulación impulsado 3'UTR, en que el ensayo proporciona una medida funcional de los genes miARN focalización, y la prueba binario de un solo reportero :: 3'UTR contra un solo miARN puede abo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.
Materials
| Reagents | ||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 |
| EGTA | Sigma | E3889 |
| ATP | Sigma | FLAAS |
| DTT | Sigma | D0632 |
| MgSO4 | Sigma | M7506 |
| CoA | Sigma | C4282 |
| luciferin | Sigma | L9504 |
| NaCl | Sigma | S7653 |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 |
| BSA | Sigma | A2153 |
| NaN3 | Sigma | S2002 |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| FBS | Sigma | F2442 |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 |
| Trypsin | T2600000 | |
| Consumables | ||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 |
| Instruments | ||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
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