Upptäckt av miRNA mål i hög kapacitet Använda 3'LIFE analys
Summary
Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.
Abstract
Självlysande Identifiering av funktionella element i 3'UTRs (3'LIFE) möjliggör snabb identifiering av mål för specifika miRNA inom en rad av hundratals frågas 3'UTRs. Målidentifiering är baserad på den dubbla luciferasanalysen, som detekterar bindning vid mRNA-nivå genom att mäta translations utsignal, vilket ger en funktionell utläsning av miRNA inriktning. 3'LIFE använder generiska buffertar och reagenser och allmänt tillgängliga bibliotek reporter, vilket gör genomet hela skärmar genomförbart och kostnadseffektivt. 3'LIFE kan utföras antingen i en vanlig labb inställning eller skalas upp med hjälp av flytande robotar hantering och andra hög genomströmning instrumentering. Vi visar tillvägagångssättet med hjälp av en datauppsättning av mänskliga 3'UTRs klonade i 96-brunnsplattor och två test miRNA, låt-7c och MIR-10b. Vi visar hur du utför DNA-preparation, transfektion, cellodling och luciferasanalyser i 96-brunnsformat och tillhandahålla verktyg för dataanalys. Sammanfattningsvis 3'LIFE är mycket reproducerbar, snabb, systematisk, och identifierar högt förtroende mål.
Introduction
Det övergripande målet med denna metod är att identifiera och exakt kartlägga mikroRNA (miRNA) mål i hög genomströmning. MiRNA endogena icke-kodande RNA ~ 22 nukleotider i längd. Efter transkription och bearbetning, är mogna miRNA införlivas i ett proteinkomplex som kallas RNA-inducerad tysta komplex (RISC). Varje miRNA guidar RISC att rikta delar i huvudsak återfinns 3'untranslated regioner (3'UTRs) av budbärar-RNA (mRNA), vilket resulterar i en omräknings förtryck eller mRNA klyvning 1. Mirna erkänner målplatser baserade på standard Watson-Crick och G: U vingla basparning, och är degenererade i naturen, innehåller flera inkompatibla baspar och utbuktande regioner. Många miRNA är i stort sett bevarad från växter till människor 2,3, där de spelar en mängd olika biologiska roller. I metazoans miRNA kan påverka flera biologiska processer inklusive cell öde beslut 4, utvecklings timing 5 </sup>, Och ofta uppvisar vävnadsspecifika uttrycksmönster 6,7. Mirna misexpression kan också resultera i avvikande genreglering, som kan ha ett betydande inflytande på cellens beteende enbart baserat på funktionen av målgener. Som sådan är miRNA kopplade till ett brett spektrum av sjukdomar, inklusive neurodegeneration 8,9, diabetes 10 och cancer 11. Bioinformatiska och våt-bänk tillvägagångssätt tyder på att varje miRNA kan vara i stånd att rikta hundratals till tusentals olika mRNA 12-14, vilket tyder på att hög genomströmning eller genomet breda strategier behövs för att undersöka denna stora grupp av potentiella interaktioner.
Identifiera målgener är en kritisk komponent i mekanistiskt definiera miRNA funktion, och att göra det forskare måste kunna avslöja mål i stor skala. Flera metoder har utvecklats för att identifiera miRNA mål, inklusive bioinformatiska prediktionsalgoritmer, hög genomströmning sekvenseringriktad mRNA, och reporter baserade analyser. Var och en av dessa metoder har inneboende styrkor och svagheter. Med tanke på att miRNA inriktning styrs av sekvensspecificitet, notably av nukleotider 2-6 av miRNA (benämnd såddregionen), flera algoritmer har utvecklats för att förutsäga miRNA mål i hela genomet hos många organismer. Dessa algoritmer är utbildade med hjälp av observerade baspar motiv av validerade miRNA mål, och ofta använda parametrar såsom stränga utsäde parning, bevarandeområde, och / eller termodynamisk stabilitet 15. Även om dessa filter förfina stort antal förmodade mål med tillräcklig komplementaritet endast höga förtroende mål, kan de utesluter artspecifika och icke-kanoniska miRNA målställen, som nyligen bevis tyder är utbredd 16-24. Dessutom dessa förutsägelser inte hänsyn till mekanismer för mRNA behandling som exkluderar miRNA målställen, såsom alternativ polyadenylering25 RNA redigering 26, RNA metylering 27, och samverkande bindning. Som sådan, har höga falska positiva och falska negativa resultat har rapporterats för många algoritmer 22,24,28. Även om dessa algoritmer är användbara för att identifiera kandidat miRNA mål för efterföljande experimentell validering, dessa höga felprocent begränsa effekten av bioinformatiska metoder för systematisk miRNA måldetektering.
Att systematiskt sond för interaktioner mellan en given miRNA och potentiellt riktade 3'UTRs har vi utvecklat en hög genomströmning analys kallas Självlysande Identifiering av funktionella element i 3'UTRs (3'LIFE) 24. Denna analys mäter direkta växelverkan och translationell förtryck av test 3'UTR av en fråga miRNA med hjälp av en dubbel luciferas reportersystem. I detta system är 3'UTR av en gen av intresse klonad nedströms om eldflugeluciferas (Fluc) reporter läsram. De reporter nackdelartruct samtransfekteras med en fråga miRNA i HEK293T celler. MiRNA inriktning bestäms genom att mäta den relativa förändringen mellan test Fluc :: 3'UTR reporter och en andra icke-specifik Renilla luciferas reporter. Viktigt luciferasanalyser upptäcka funktionella miRNA / mRNA interaktioner som påverkar translations produktionen av reportern. Detta är en viktig fördel jämfört med traditionella metoder för att upptäcka miRNA reglering, såsom RT-qPCR och Western blöts, eftersom detta kringgår skillnader i mRNA nedbrytning och translationell förtryck, liksom förändringar i protein överflöd oberoende av 3'UTR baserad reglering.
Luciferasanalyser är allmänt används för att validera direkta miRNA mål på grund av sin relativa enkelhet och känslighet, men deras användning i hög genomströmning skärmar begränsas av höga kostnader som är förknippade med förbrukningsreagens, avsaknaden av 3'UTR bibliotek från offentliga källor, och frånvaron standardiserade luciferas protocols, vilket leder till svårigheter att jämföra funktionell repression över flera datamängder. För att underlätta användningen av 3'LIFE analysen har vi lagt vikt vid förenkling av experimentell design, utnyttjande av icke-kommersiella transfektion 24 och luciferasreagens 29, skapar en 3'UTR bibliotek som regelbundet uppdateras och utökas, och är tillgänglig via en offentlig plasmid förvar 30.
Skalbarheten av 3'LIFE analysen möjliggör screening av ett stort 3'UTR bibliotek för inriktning på en viss miRNA utan förspänning skärmen mot bioinformatically identifierade generna. Förutom att testa kanoniska och förutsedd interaktion, gör detta systematiskt tillvägagångssätt att identifiera nya mål drivs via icke-kanoniska och / eller arter-specifika interaktioner. Viktigt är effekten av miRNA inriktning på proteinproduktion i allmänhet förstås leda till blygsam translationell förtryck 15,31 </ Sup>, vilket tyder på att en primär roll miRNA förordningen är att finjustera protein utgång, skyddar mot avvikande nivåer av genuttryck, och ger robusthet cell särskilda program 32,33. Känsligheten hos analys luciferas i kombination med den inneboende stort antal negativa miRNA / mRNA interaktioner i 3'LIFE skärmen kan upptäcka subtila effekter av miRNA inriktning på ett stort antal gener, och identifiering av flera komponenter av genen nätverk som regleras av en viss miRNA 24.
Här beskriver vi 3'LIFE protokollet, och visa att det är genomförbart genom screening två väl karakteriserade miRNA, MIR-10b och låt-7c mot en panel av 275 mänskliga 3'UTRs (Figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Den 3'LIFE analysen identifierar funktionella miRNA mål i 3'UTRs i hög genomströmning. Denna analys är användbar för forskare som vill experimentellt identifiera ett stort antal förmodade mål för sin miRNA av intresse. Den 3'LIFE analysen är en kraftfull metod för att fråga efter 3'UTR driven reglering i att analysen ger en funktionell mått på miRNA inriktning, och den binära testning av en enda reporter :: 3'UTR mot en enda miRNA kan tryggt ta itu den målsökande status för enskilda…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.
Materials
| Reagents | ||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 |
| EGTA | Sigma | E3889 |
| ATP | Sigma | FLAAS |
| DTT | Sigma | D0632 |
| MgSO4 | Sigma | M7506 |
| CoA | Sigma | C4282 |
| luciferin | Sigma | L9504 |
| NaCl | Sigma | S7653 |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 |
| BSA | Sigma | A2153 |
| NaN3 | Sigma | S2002 |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| FBS | Sigma | F2442 |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 |
| Trypsin | T2600000 | |
| Consumables | ||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 |
| Instruments | ||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
References
- Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116 (2), 281-297 (2004).
- Pasquinelli, A. E., et al. Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA. Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).
- Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. P. MicroRNAs in plants. Genes Dev. 16 (13), 1616-1626 (2002).
- Ivey, K. N., et al. MicroRNA regulation of cell lineages in mouse and human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 2 (3), 219-229 (2008).
- Lee, R. C., Feinbaum, R. L., Ambros, V. The C. elegans heterochronic gene lin-4 encodes small RNAs with antisense complementarity to lin-14. Cell. 75 (5), 843-854 (1993).
- Wienholds, E., et al. MicroRNA expression in zebrafish embryonic development. Science. 309 (5732), 310-311 (2005).
- Darnell, D. K., et al. MicroRNA expression during chick embryo development. Dev Dyn. 235 (11), 3156-3165 (2006).
- Jin, P., Alisch, R. S., Warren, S. T. RNA and microRNAs in fragile X mental retardation. Nat Cell Biol. 6 (11), 1048-1053 (2004).
- Kim, J., et al. A MicroRNA feedback circuit in midbrain dopamine neurons. Science. 317 (5842), 1220-1224 (2007).
- Poy, M. N., et al. A pancreatic islet-specific microRNA regulates insulin secretion. Nature. 432 (7014), 226-230 (2004).
- Calin, G. A., Croce, C. M. MicroRNA signatures in human cancers. Nature Reviews Cancer. 6 (11), 857-866 (2006).
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19 (1), 92-105 (2009).
- Paraskevopoulou, M. D., et al. DIANA-microT web server v5.0: service integration into miRNA functional analysis workflows. Nucleic Acids Res. 41 (Web Server issue), W169-W173 (2013).
- Krek, A., et al. Combinatorial microRNA target predictions. Nat Genet. 37 (5), 495-500 (2005).
- Bartel, D. P. MicroRNAs: target recognition and regulatory functions. Cell. 136 (2), 215-233 (2009).
- Vella, M. C., Choi, E. Y., Lin, S. Y., Reinert, K., Slack, F. J. The C. elegans microRNA let-7 binds to imperfect let-7 complementary sites from the lin-41 3’UTR. Genes Dev. 18 (2), 132-137 (2004).
- Lal, A., et al. miR-24 Inhibits cell proliferation by targeting E2F2, MYC, and other cell-cycle genes via binding to ‘seedless’ 3’UTR microRNA recognition elements. Molecular Cell. 35 (5), 610-625 (2009).
- Cevec, M., Thibaudeau, C., Plavec, J. N. M. R. NMR structure of the let-7 miRNA interacting with the site LCS1 of lin-41 mRNA from Caenorhabditis elegans. Nucleic Acids Res. 38 (21), 7814-7821 (1093).
- Shin, C., et al. Expanding the microRNA targeting code: functional sites with centered pairing. Molecular Cell. 38 (6), 789-802 (2010).
- Azzouzi, I., et al. MicroRNA-96 directly inhibits gamma-globin expression in human erythropoiesis. PLoS One. 6 (7), e22838 (2011).
- Chen, J., et al. miR-193b Regulates Mcl-1 in Melanoma. Am J Pathol. 179 (5), 2162-2168 (2011).
- Chi, S. W., Hannon, G. J., Darnell, R. B. An alternative mode of microRNA target recognition. Nat Struct Mol Biol. 19 (3), 321-327 (1038).
- Jiao, L. R., et al. MicroRNAs targeting oncogenes are down-regulated in pancreatic malignant transformation from benign tumors. PLoS One. 7 (2), e32068 (2012).
- Wolter, J. M., Kotagama, K., Pierre-Bez, A. C., Firago, M., Mangone, M. 3’LIFE: a functional assay to detect miRNA targets in high-throughput. Nucleic Acids Res. , (2014).
- Mangone, M., et al. The landscape of C. elegans 3’UTRs. Science. 329 (5990), 432-435 (2010).
- Ekdahl, Y., Farahani, H. S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development. Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).
- Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation. Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).
- Zhou, P., et al. Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3’UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs. Plos One. 8 (7), e68204 (2013).
- Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis. Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).
- Seiler, C. Y., et al. DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research. Nucleic Acids Res. , (2013).
- Baek, D., et al. The impact of microRNAs on protein output. Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).
- Ebert, M. S., Sharp, P. A. Roles for MicroRNAs in Conferring Robustness to Biological Processes. Cell. 149 (3), 515-524 (2012).
- Pelaez, N., Carthew, R. W. Biological robustness and the role of microRNAs: a network perspective. Current Topics in Developmental Biology. 99, 237-255 (2012).
