Rivelazione di bersagli miRNA in high-throughput usando il saggio 3'LIFE
Summary
Luminescent identification of functional elements in 3’ untranslated regions (3’UTRs) (3’LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3’UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.
Abstract
Luminescente Identificazione di elementi funzionali a 3'UTRs (3'LIFE) permette la rapida identificazione di bersagli di miRNA specifici all'interno di un array di centinaia di 3'UTRs interrogati. Identificazione di destinazione è basato sul dosaggio dual-luciferasi, che rileva vincolante a livello di mRNA misurando uscita traslazionale, dando una lettura funzionale miRNA targeting. 3'LIFE utilizza i buffer non proprietari e reagenti, e biblioteche giornalista pubblicamente disponibili, rendendo gli schermi genome-wide fattibile e conveniente. 3'LIFE può essere eseguita in un ambiente di laboratorio standard o scalato utilizzando robot gestione dei liquidi e altra strumentazione high-throughput. Illustriamo l'approccio con un set di dati di 3'UTRs umani clonati in piastre a 96 pozzetti e due miRNA test, lasciamo-7c e miR-10b. Dimostriamo come eseguire preparazione del DNA, trasfezione, coltura cellulare e saggi di luciferasi in formato 96-bene, e di fornire gli strumenti per i datianalisi. In conclusione 3'LIFE è altamente riproducibile, veloce, sistematico, e individua gli obiettivi alti di fiducia.
Introduction
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di individuare e mappare con precisione microRNA target (miRNA) in high-throughput. MiRNA sono endogeni RNA non codificanti ~ 22 nucleotidi di lunghezza. In seguito la trascrizione e la lavorazione, miRNA maturi sono incorporati in un complesso proteico chiamato RNA induced silencing complex (RISC). Ogni miRNA guida il RISC ad elementi situati principalmente nelle regioni 3'untranslated (3'UTRs) di RNA messaggeri (mRNA) di destinazione, con conseguente sia repressione traduzione o mRNA cleavage 1. Mirna riconoscere siti di destinazione basate su standard di Watson-Crick e G: U Wobble appaiamento delle basi, e sono degenerati in natura, contenente più paia di basi non corrispondenti e le regioni si gonfiarono. Molti miRNA sono ampiamente conservati dalle piante all'uomo 2,3, dove giocano una vasta gamma di ruoli biologici. In metazoi miRNA possono influenzare molteplici processi biologici, tra cui le decisioni destino cellulare 4, i tempi di sviluppo 5 </sup>, E spesso mostrano tessuti specifici modelli di espressione 6,7. Mirna misexpression può anche provocare regolazione genica aberranti, che può avere notevole influenza sul comportamento cellulare basato esclusivamente sulla funzione dei geni bersaglio. Come tale, miRNA sono collegati ad una vasta gamma di malattie, compreso neurodegenerazione 8,9, diabete e cancro 10 11. Bioinformatica e gli approcci bagnato banco suggeriscono che ogni miRNA può essere in grado di colpire centinaia di migliaia di mRNA distinte 12-14, indicando che gli approcci a livello di high-throughput o del genoma sono tenuti a sondare questa grande piscina di potenziali interazioni.
Identificare geni bersaglio è una componente critica di meccanicamente definire funzione miRNA, e per farlo i ricercatori deve essere in grado di rivelare gli obiettivi su larga scala. Diversi approcci sono stati sviluppati per identificare bersagli miRNA, tra cui algoritmi di predizione bioinformatica, high-throughput sequencingmRNA di mirati e giornalista saggi basa. Ognuno di questi approcci ha punti di forza e di debolezza intrinseci. Dato che il targeting miRNA è guidata dalla specificità di sequenza, in particolare di 2-6 nucleotidi del miRNA (definita regione di seme), diversi algoritmi sono stati sviluppati per prevedere bersagli miRNA nel genoma di molti organismi. Questi algoritmi sono addestrati con i motivi osservati base-accoppiamento di obiettivi miRNA validati, e spesso utilizzano parametri quali l'associazione rigorosa seme, la conservazione del sito, e / o la stabilità termodinamica 15. Mentre questi filtri perfezionare il gran numero di bersagli putativi con complementarità sufficiente per obiettivi solo un'elevata fiducia, essi possono escludere determinate specie e non canonici siti bersaglio miRNA, che recenti evidenze suggerisce sono diffusi 16-24. Inoltre, queste previsioni non tengono conto dei meccanismi di trasformazione mRNA che escludono siti bersaglio miRNA, come poliadenilazione alternativa25, RNA editing 26, RNA metilazione 27, e cooperativo vincolante. In quanto tale, gli alti tassi di falsi positivi e falsi negativi sono stati riportati per molti algoritmi 22,24,28. Mentre questi algoritmi sono utili per identificare candidati bersagli miRNA per la successiva validazione sperimentale, questi tassi di errore elevati limitano l'efficacia di approcci bioinformatici per la rilevazione sistematica bersaglio miRNA.
Per sondare sistematicamente per le interazioni tra un dato miRNA e 3'UTRs potenzialmente mirate abbiamo sviluppato un saggio ad alta prestazione denominato luminescente Identificazione di elementi funzionali in 3'UTRs (3'LIFE) 24. Questo saggio misura interazioni dirette e repressione di traslazione del 3'UTR di prova da una query miRNA utilizzando un sistema duale giornalista luciferasi. In questo sistema, il 3'UTR di un gene di interesse viene clonato a valle della luciferasi (fluc) giornalista telaio lettura lucciola. I contro giornalistatruct è cotransfected con una query miRNA nelle cellule HEK293T. Mirna Il targeting è determinata misurando la variazione relativa tra il fluc prova :: giornalista 3'UTR e un secondo non specifico giornalista Renilla luciferasi. È importante sottolineare che, saggi luciferasi rilevano funzionali interazioni miRNA / mRNA che influenzano l'uscita di traslazione del giornalista. Questo è un vantaggio fondamentale rispetto ai metodi tradizionali per individuare regolamentazione miRNA, come la RT-qPCR e macchie occidentali, che questo ignora le differenze di degradazione mRNA e di repressione traslazionale, così come i cambiamenti nelle proteine abbondanza indipendente di regolamentazione basata 3'UTR.
Saggi luciferasi sono ampiamente utilizzati per convalidare bersagli diretti miRNA a causa della loro relativa semplicità e sensibilità, ma il loro uso in schermi high-throughput è limitato dai costi elevati associati con reagenti consumabili, la mancanza di librerie 3'UTR da fonti pubbliche, e l'assenza di standard luciferasi protocols, con conseguenti difficoltà nel confrontare repressione funzionale tra più insiemi di dati. Per facilitare l'uso del test 3'LIFE, abbiamo posto l'accento sulla semplificazione del disegno sperimentale, l'utilizzo di trasfezione 24 e luciferasi reagenti non commerciali 29, la creazione di una biblioteca 3'UTR che viene regolarmente aggiornato e ampliato, ed è disponibile attraverso un repository plasmide pubblico 30.
La scalabilità del saggio 3'LIFE permette proiezione di una grande biblioteca 3'UTR per il targeting per un dato miRNA, senza falsare la schermata verso geni bioinformatically identificati. Oltre a testare le interazioni canoniche e previste, questo approccio sistematico permette l'identificazione di nuovi bersagli azionati tramite interazioni non canonici e / o specie-specifici. È importante sottolineare che l'effetto di miRNA targeting produzione di proteine è generalmente inteso a provocare modesto repressione traslazionale 15,31 </ Sup>, suggerendo che un ruolo primario della regolamentazione miRNA è quello di mettere a punto l'uscita di proteine, la protezione contro i livelli aberranti di espressione genica, e dare maggiore solidità alla cella programmi specifici 32,33. La sensibilità del saggio luciferasi combinato con il intrinsecamente gran numero di interazioni negative miRNA / mRNA nella schermata 3'LIFE permette la rilevazione di effetti sottili di miRNA mira su un gran numero di geni, e l'identificazione di componenti multipli di reti geniche che sono regolati da un dato miRNA 24.
Qui si descrive il protocollo 3'LIFE, e dimostrare che è fattibilità per lo screening due miRNA ben caratterizzati, miR-10b e let-7c contro un gruppo di 275 3'UTRs umani (Figura 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Il test 3'LIFE identifica obiettivi funzionali miRNA in 3'UTRs a high-throughput. Questo test è utile per i ricercatori che desiderano identificare sperimentalmente un gran numero di bersagli putativi per la loro miRNA di interesse. Il saggio 3'LIFE è un approccio potente per eseguire query per 3'UTR regolazione guidata, in quanto il test fornisce una misura funzionale di miRNA targeting e la sperimentazione binario di un singolo giornalista :: 3'UTR contro un singolo miRNA può tranquillamente aff…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.
Materials
| Reagents | ||
| glycylglycine | Sigma | G1127-25G |
| Kx PO4 | Sigma | P2222 |
| EGTA | Sigma | E3889 |
| ATP | Sigma | FLAAS |
| DTT | Sigma | D0632 |
| MgSO4 | Sigma | M7506 |
| CoA | Sigma | C4282 |
| luciferin | Sigma | L9504 |
| NaCl | Sigma | S7653 |
| Na2EDTA | Sigma | E0399 |
| K H2 P O4 | Sigma | 1551139 |
| BSA | Sigma | A2153 |
| NaN3 | Sigma | S2002 |
| Coelenterazine | Sigma | C3230 |
| PBS/HEPES | Corning | 21-040-CV |
| DMEM | Sigma | D5546 |
| FBS | Sigma | F2442 |
| Pennicilin/Streptomicin | Sigma | P4333 |
| Trypsin | T2600000 | |
| Consumables | ||
| MaxiPrep Kit | Promega | A2392 |
| 96-well miniprep plate | Pall | 8032 |
| 96-well shuttle plates | Lonza | V4SP-2096 |
| 5x Lysis Buffer | Promega | E1941 |
| Instruments | ||
| 96-well GloMax Plate Reader | Promega | E9032 |
| Biomech FX Liquid Handler Robot | Beckmann | A31842 |
| 4D-Nucleofector Core Unit | Lonza | AAF-1001 |
| 96-well Shuttle System | Lonza | AAM-1001 |
| Cell Counter Countess | Invitrogen | C10227 |
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