Kontrollert mikrofluid Miljø for Dynamic Gransking av røde blodceller Aggregation
Summary
Protokollen er beskrevet detaljer en eksperimentell prosedyre for å kvantifisere røde blodceller (RBC) tilslag under en kontrollert og konstant skjærhastighet, basert på bildebehandlingsteknikker. Målet med denne protokollen er å forholde RBC aggregerte størrelser til tilsvarende skjærhastighet i et kontrollert microfluidic miljø.
Abstract
Blod, som en ikke-Newtonsk biofluid, representerer i fokus for mange studier i hemorheology feltet. Blodbestanddeler omfatter røde blodceller, hvite blodceller og blodplater som er suspendert i blodplasma. På grunn av den mengde av RBC-ene (40% til 45% av det blodvolum), dikterer deres oppførsel reologiske oppførsel av blod, spesielt i mikrosirkulasjonen. Ved meget lave skjærhastigheter, er RBCs ses å montere og danner enheter kalt aggregater, noe som fører til ikke-Newtonske oppførsel av blod. Det er viktig å forstå betingelsene for tilslag formasjonen for å forstå blod reologi i mikrosirkulasjonen. Protokollen er beskrevet her beskriver eksperimentelle prosedyren for å bestemme kvantitativt RBC aggregater i mikrosirkulasjonen under konstant skjærhastighet, basert på bildebehandling. For dette formål er RBC-suspensjoner undersøkt og analysert på 120 x 60 um poly-dimetyl-siloksan (PDMS) mikrokanaler. RBC-suspensjoner er entregnet ved hjelp av et andre fluid for å oppnå en lineær hastighetsprofil i blodet sjiktet og således oppnå et vidt spekter av faste skjærhastigheter. Skjærhastigheten bestemmes ved hjelp av en mikro Particle bilde velocimetry (μPIV) system, mens RBC aggregater er visualisert ved hjelp av høyhastighetskamera. Videoene fanget av RBC aggregatene er analysert ved hjelp av bildebehandlingsteknikker for å fastsette den samlede størrelser basert på bildene intensiteter.
Introduction
Røde blodceller (RBC) spiller en avgjørende rolle i å bestemme reologiske oppførsel av blod. De er nesten bemerkelsesverdig ansvarlig for de spesielle egenskapene til blod in vitro og in vivo. Under fysiologiske betingelser, RBC okkupere 40% til 45% av blodvolumet. I mikrosirkulasjonen, bare RBCs opptar opptil 20% av blodvolumet som følge av mindre fartøy diametere og plasma skimming effekt en. Dette fenomenet av plasma reduksjon i mikrosirkulasjonen er kjent som Fåhræus effekt. Ved lave skjærhastigheter, RBC-er i stand til å bygge bro sammen og danner en dimensjonal eller tre-dimensjonale strukturer som kalles "rouleaux" eller aggregater derav bidrar til den ikke-Newtonske oppførsel av blod. Imidlertid er mekanismen for RBC aggregering ikke helt forstått. To teorier for å modellere aggregering av RBCs: brokopling av celler teorien på grunn av tverrbinding av makromolekylene 2 og kraften severdsjon teori forårsaket av utarming av molekylene på grunn av den osmotiske gradienten 3.
Typisk for menneskeblod, aggregater dannes ved meget lave skjærhastigheter 4 som strekker seg fra 1 til 10 sek -1. Over dette område, RBCs en tendens til å flyte og disaggregert separat i beholderen.
Forstå betingelsene for aggregater dannelsen er av stor betydning for hemorheology feltet i form av å definere blodets reologisk atferd. Disse aggregater blir ofte sett på macrocirculation nivå (> 300 um diameter) 5. På denne skalaen, blir blod betraktes som en Newtonsk væske, og en homogen blanding. Imidlertid er disse aggregater sjelden sett i kapillaren nivået (4-10 mikrometer i diameter), og er vanligvis en indikasjon på patologiske tilstander slik som diabetes og fedme 6. Andre patologiske tilstander som kan endre RBC aggregering inkluderer inflammatoriske eller infeksiøse tilstander,kardiovaskulære sykdommer som høyt blodtrykk eller åreforkalkning, genetiske sykdommer og kroniske sykdommer 7. Derfor forstå RBC aggregering mekanismen og analysere disse enhetene (ved å definere en sammenheng mellom størrelsen av disse aggregater og strømningsforhold) kan føre til forståelsen av virkemåten microrheological av blod og dermed den i forbindelse med kliniske anvendelser.
RBC-aggregater kan endres av en rekke faktorer slik som hematokrit (volum av RBC i blod), skjærhastigheten, diameter fartøyet, RBC membranen stivhet og den suspenderende medium sammensetningen 8-10. Derfor er kontrollerte betingelser som kreves for effektivt å analysere RBC aggregater. Flere metoder er i stand til å analysere aggregatdannelse ved å gi statiske aggregering målinger (aggregering index) som gir relevant informasjon om blod atferd. Disse metodene inkluderer blant annet den senkningMetode 11, lyset overføringsmetode 12, lysrefleksjon metode 13 og den lave skjærkraftviskositet metode 14.
Få studier har forsøkt å studere RBC aggregering og fastslå graden av aggregering i kontrollerte strømningsforhold 15-17. Men disse studiene indirekte undersøke RBC aggregatstørrelser ved å bestemme forholdet mellom opptatt plass i en skjær system målt på grunnlag av mikroskopiske blodbilder som gir informasjon om graden av aggregering, så vel som den lokale viskositet.
Vi vil derfor presentere en ny prosedyre for å direkte kvantifisere RBC aggregater i mikrosirkulasjonen, dynamisk under kontrollerte og konstant skjærhastigheter. RBC-suspensjoner innesluttet, i en dobbelt Y-microchannel (som illustrert i figur 1), med et fosfatbufret saltvann (PBS) løsning og dermed forårsaker en skjærstrømning i blodet lag. Innenfor dette blodet lag en konstant shear hastighet kan oppnås. RBC-suspensjoner blir testet ved forskjellig hematokrit (H) nivåer (5%, 10% og 15%) og under forskjellige skjærhastigheter (2-11 sek -1). Blodet hastighet og skjærhastighet bestemmes ved hjelp av en mikro Particle bilde velocimetry (μPIV) system mens strømmen er visualisert ved hjelp av høyhastighetskamera. De oppnådde resultater blir så behandlet med en MATLAB kode basert på bildeintensitetene for å påvise og bestemme RBCs aggregatstørrelser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ved hjelp av foreliggende metode, er det mulig å analysere kvalitativt og kvantitativt RBC aggregater under forskjellige strømningsforhold og hematocrits. For vellykket testing og samlet deteksjon, er det avgjørende å finne riktig hastighetsforholdet mellom de to væskene på microchannel oppføring. Dette forhold er meget viktig for å oppnå et optimalt blod lagtykkelse hvor hastighetsprofilen er kvasi-lineær 19.
En annen viktig faktor for vellykket testing er en god bildek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada. Microfabrication ble utført med støtte fra McGill nanoverktøy Microfab anlegget ved McGill University og Institutt for elektronikk ved Carleton University.
Materials
| SU8-50 epoxy based negative Photo-resist | MicroChem Corp. | ||
| SU8-50 developer | MicroChem Corp. | ||
| Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
| PE-50 series Plasma system | Plasma Etch | PE-50 series | |
| Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | FisherSci | B367861 | |
| Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F | |
| Poshpate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Tracer fluorescent particles solution (15 mL) | FisherSci | R800 | |
| Aggregometer | RheoMeditech | Rheo Scan AnD300 | |
| Glass syringes (50 µL) | Hamilton | 80965 | |
| Tubing (Tygon) | FisherSci | AAA00001 | |
| High speed camera (Basler) | Graftek Imaging Inc. | basler acA2000-340km | A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used. |
| Double pulsed camera | LaVision | Imager Intense | |
| Microscope MITAS | LaVision | MITAS | |
| Nd:YAG laser | New Wave Research | Solo-II | |
| Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) | Chemyx Inc. and Harvard Apparatus | Nexus3000 and PicoPlus | |
| DaVis software | LaVision | Davis |
References
- Perkkio, J., Keskinen, R. Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming. Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).
- Chien, S., Jan, K. Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation. Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).
- Neu, B., Meiselman, H. J. Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions. Biophys. J. 83 (5), 2482-2490 (2002).
- Schmid-Schönbein, H., Gaehtgens, P., Hirsch, H. On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro. J. Clin. Invest. 47 (6), 1447-1454 (1968).
- Pries, A. R., Secomb, W. Rheology of the microcirculation. Clin. Hemorheol. Microcirc. 29 (3-4), 143-148 (2003).
- Baskurt, O. K., Neu, B., Meiselman, H. J. . Red Blood Cell Aggregation. , (2011).
- Cho, Y. I., Mooney, M. P., Cho, D. J. Hemorheological disorders in diabetes mellitus. J. Diabetes Sci. Technol. 2 (6), 1130-1138 (2008).
- Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, M. W., Meiselman, H. J. . Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. , (2007).
- Lindqvist, T. The viscosity of the blood in narrow capillary tubes. Am. J. Physiol.-Legacy Content. 96, 562-568 (1931).
- Goldsmith, H. L., Cokelet, G. R., Gaehtgens, P. R. Fåhraeus: Evolution of his concepts in cardiovascular physiology. Am. J. Physiol. 257 (3), H1005-H1015 (1989).
- Fåhraeus, R. The suspension stability of the blood. Physiol. Rev. 9 (2), 241-274 (1929).
- Bauersachs, R. M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J. Determination of specific red blood cell aggregation indices via an automated system. Clin. Hemorheol. 9 (1), 1-25 (1989).
- Hardeman, M. R., Dobbe, J. G., Ince, C. The laser-assisted optical rotational cell analyzer (lorca) as red blood cell aggregometer. Clin. Hemorheol. Microcirc. 25 (1), 1-11 (2001).
- Rampling, M. W. Red cell aggregation and yield stress. Clinical Blood Rheology. , (1988).
- Dusting, J., Kaliviotis, E., Balabani, S., Yianneskis, M. Coupled human erythrocyte velocity field and aggregation measurements at physiological haematocrit levels. J. Biomech. 42 (10), 1438-1443 (2009).
- Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity: modelling using shear fields measured by a µPIV based technique. Med. Eng. Phys. 33 (7), 824-831 (2011).
- Sherwood, J. M., Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity and velocity distributions of aggregating and non-aggregating blood in a bifurcating microchannel. Biomech. Model. Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).
- Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie International Edition England. , 551-577 (1998).
- Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Design of a microfluidic system for red blood cell aggregation investigation. J. Biomech. Eng. 136 (6), 064501-1-064501-5 (2014).
- Pitts, K. L., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows. J. Vis. Exp. (74), e50314 (2013).
- Bitsch, L., Oleson, L. H., Westergaard, C. H., Bruus, H., Klank, H., Kutter, J. P. Micro particle-image velocimetry of bead suspensions and blood flows. Exp. Fluids. 39 (3), 507-513 (2005).
- Wereley, S. T., Gui, L., Meinhart, C. D. Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry. AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).
- Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping. Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).
- Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods. Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302 (2012).
- Bhamare, M. G., Patil, D. S. Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study. Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).
- Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform. Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).
- Jambhekar, N. D. Red blood cells classification using image processing. Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
