Kırmızı Kan Hücresi Toplama Dinamik Soruşturma Kontrollü mikroakışkan Çevre
Summary
protokol görüntü işleme tekniklerine dayanan, detay kontrollü ve sürekli kayma hızı altında Eritrosit (RBC) agrega ölçmek için deneysel bir prosedür tarif. Bu protokolün amacı, kontrollü bir mikroakışkan bir ortamda gelen kayma oranı RBC agrega boyutları ilişkilendirmek olduğunu.
Abstract
Kan, bir Newtonian olmayan biyo-sıvı olarak, Hemorheology alanında birçok çalışmalar odağı temsil eder. Kan bileşenleri, kırmızı kan hücreleri, kan plazması içinde süspansiyon haline getirilmiş olan, beyaz kan hücreleri ve trombositler bulunmaktadır. Nedeniyle eritrosit bolluğu (kan hacminin% 40 ila 45%), onların davranışları, özellikle mikrosirkülasyondaki kanın reolojik davranışını belirler. Çok düşük kesme hızlarında, eritrositler monte görülmektedir ve form kişiler kan Newtonian olmayan davranışa neden olan agrega denir. Bu mikrosirkülasyondaki kan reolojisini kavrayabilme agrega oluşum koşullarını anlamak çok önemlidir. Burada açıklanan protokol görüntü işleme dayalı, sürekli kayma hızı altında kantitatif mikrosirkülasyonda RBC büyüklüklerinin belirlenmesi deneysel prosedür ayrıntıları. Bu amaçla, RBC-süspansiyonlar test edilmiş ve 120 x 60 mm poli-dimetil-siloksan (PDMS) mikrokanallar analiz. RBC-süspansiyonlar ent vardırKan katmanı içinde bir doğrusal hız profilini elde etmek ve böylelikle sabit bir kesme oranları geniş bir aralığını elde etmek için, ikinci bir sıvı ile yağmur. RBC agrega yüksek hızlı bir kamera kullanılarak görüntülendi sırasında kesme hızı, mikro görüntüleme ölçümleri (μPIV) sistemi kullanılarak belirlenir. RBC agrega çekilen videoları görüntüleri şiddetleri dayalı toplam boyutlarını belirlemek amacıyla görüntü işleme teknikleri kullanılarak analiz edilmektedir.
Introduction
Kırmızı kan hücreleri (eritrositler) kanın reolojik davranışlarını belirleyen çok önemli bir rol oynamaktadır. Neredeyse tek başına, in vitro ve in vivo olarak kan belli özelliklere sorumludur. Fizyolojik koşullar altında, eritrositler kan hacminin% 40 45% işgal. Mikrosirkülasyondaki, eritrositler nedeniyle sadece küçük damar çapları ve etkisi 1 kaymağını plazmaya kan hacminin% 20 kadar işgal. Mikrosirkülasyon plazma azalma Bu olgu Fåhræus etkisi olarak bilinir. Düşük kesme hızlarında, RBC bu nedenle kan Newtonian olmayan davranışlar katkıda birlikte köprü ve "Rouleaux" ya da agregalar olarak adlandırılan tek boyutlu veya üç boyutlu yapıları oluşturmak mümkündür. Bununla birlikte, rbc toplanması mekanizması tam olarak anlaşılmış değildir. İki teori eritrosit agregasyonunu model vardır: Hücreler teorisinin köprüleme nedeniyle makromoleküllerin 2 çapraz bağlanması ve kuvvet attrac içintion teorisi nedeniyle osmotik gradyan 3 moleküllerin tükenmesi neden oldu.
Tipik haliyle, insan kanı, agrega 1 ila 10 saniye -1 kadar çok düşük kesme oranlarında 4 de oluşturur. Bu aralığın üstünde, RBCs bölmekte ve damar içinde ayrı akış eğilimindedir.
Agrega oluşum koşullarını anlamak kanın reolojik davranışını tanımlayan açısından Hemorheology alanına büyük önem taşımaktadır. Bu agregalar genellikle makrodolaşım düzeyde (> 300 um çapında) 5 görülür. Bu ölçekte, kan, bir Newton tipi sıvı ve homojen bir karışım olarak kabul edilir. Bununla birlikte, bu agregaların nadir kılcal seviyesi (çapı 4-10 um) görülür ve genellikle diyabet 6 ve obezite gibi patolojik durumların bir göstergesidir. Rbc toplanması enflamatuar veya enfeksiyon durumları içerir değiştirebilir diğer patolojik durumlar,hipertansiyon veya ateroskleroz, genetik bozukluklar ve kronik hastalıklar 7 kardiyovasküler hastalıklar. Bu nedenle, RBC toplama mekanizmasının anlaşılması ve (bu agrega ve akış koşullarının büyüklüğü arasında bir ilişki tanımlayarak) bu varlıkları analiz kanın microrheological davranışının anlaşılmasına yol açabilir ve dolayısıyla klinik uygulamalara bunu ilgilidir.
RBC agregaları gibi hematokrit (kanda eritrositler hacmi), kayma hızı, damar çapı, RBC membran sertlik ve süspansiyon ortamı bileşim 8-10 gibi çeşitli faktörler tarafından değiştirilebilir. Bu nedenle, kontrollü şartlar etkin RBC agrega analiz etmek için gereklidir. Çeşitli yöntemler kan davranışları hakkında gerekli bilgileri sunuyor statik toplama ölçümleri (toplama indeksi) sağlayarak toplam oluşumunu analiz edebiliyoruz. Bu yöntemler, diğerlerinin yanı sıra, eritrosit sedimantasyon hızı dahilyöntem 11 ışık geçirgenliği yöntemi 12, ışık yansıma yöntemi 13 ve düşük kayma viskozitesi yöntemi 14.
Birkaç çalışma RBC toplanmasını çalışma ve kontrollü akış şartlarında 15-17 toplulaştırma derecesini belirlemek için çalışmışlardır. Ancak bu çalışmalar dolaylı olarak toplama derecesi yanı sıra yerel viskozite ilgili bilgi veren mikroskobik kan görüntülerde dayalı ölçülen kesme sisteminde işgal alanı oranını belirleyerek RBC toplam boyutlarını araştırmak.
Bu nedenle doğrudan RBC kontrollü ve sürekli kayma oranlarının altında, dinamik, mikrosirkülasyonda agrega ölçmek için yeni bir prosedür mevcut. Bir fosfat tamponlu salin (PBS) çözeltisi bu nedenle, kan tabakasında bir kesme akışı oluşturma, (Şekil 1 'de gösterildiği gibi) RBC-süspansiyonlar iki Y mikrokanaldaki, sürüklenir. Bu kan içinde sabit Shea katmanr oranı elde edilebilir. RBC-süspansiyonlar farklı hematokrit (H) düzeyleri (% 5,% 10 ve% 15) ve farklı kesme hızlarında (2-11 sn -1) altında test edilmiştir. Kan hızı ve kesme hızı akışı yüksek hızlı kamera ile görüntülenmiştir ise mikro Parçacık Görüntü Akımları (μPIV) sistemi kullanılarak belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar daha sonra eritrositlerde tespit ve toplam boyutlarını belirlemek için görüntü şiddetleri göre MATLAB kodu ile işlenir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut metodoloji kullanarak, niteliksel analiz etmek mümkündür ve kantitatif RBC farklı akış koşulları ve hematokrit altında toplanır. Başarılı test ve agrega tespiti için, mikro girişinde iki akışkanlar arasında uygun hız oranını belirlemek için çok önemlidir. Bu oran, hız profili 19 yarı lineer bir optimal kan tabaka kalınlığının elde edilmesi için çok önemlidir.
Başarılı test için bir başka önemli faktör iyi bir görüntü kalitesi. Yö…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Doğa Bilimleri ve Kanada'nın Mühendislik Araştırma Konseyi tarafından desteklenmiştir. Mikroüretim McGill Üniversitesi'nde McGill nanoTools MICROFAB imkan ve Carleton Üniversitesi Elektronik Bölümü desteğiyle gerçekleştirildi.
Materials
| SU8-50 epoxy based negative Photo-resist | MicroChem Corp. | ||
| SU8-50 developer | MicroChem Corp. | ||
| Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
| PE-50 series Plasma system | Plasma Etch | PE-50 series | |
| Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | FisherSci | B367861 | |
| Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F | |
| Poshpate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
| Tracer fluorescent particles solution (15 mL) | FisherSci | R800 | |
| Aggregometer | RheoMeditech | Rheo Scan AnD300 | |
| Glass syringes (50 µL) | Hamilton | 80965 | |
| Tubing (Tygon) | FisherSci | AAA00001 | |
| High speed camera (Basler) | Graftek Imaging Inc. | basler acA2000-340km | A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used. |
| Double pulsed camera | LaVision | Imager Intense | |
| Microscope MITAS | LaVision | MITAS | |
| Nd:YAG laser | New Wave Research | Solo-II | |
| Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) | Chemyx Inc. and Harvard Apparatus | Nexus3000 and PicoPlus | |
| DaVis software | LaVision | Davis |
References
- Perkkio, J., Keskinen, R. Hematocrit reduction in bifurcations due to plasma skimming. Bull. Math. Biol. 45 (1), 41-50 (1983).
- Chien, S., Jan, K. Ultrastructural basis of the mechanism of rouleaux formation. Microvasc. Res. 5 (2), 155-166 (1973).
- Neu, B., Meiselman, H. J. Depletion-mediated red blood cell aggregation in polymer solutions. Biophys. J. 83 (5), 2482-2490 (2002).
- Schmid-Schönbein, H., Gaehtgens, P., Hirsch, H. On the shear rate dependence of red cell aggregation in vitro. J. Clin. Invest. 47 (6), 1447-1454 (1968).
- Pries, A. R., Secomb, W. Rheology of the microcirculation. Clin. Hemorheol. Microcirc. 29 (3-4), 143-148 (2003).
- Baskurt, O. K., Neu, B., Meiselman, H. J. . Red Blood Cell Aggregation. , (2011).
- Cho, Y. I., Mooney, M. P., Cho, D. J. Hemorheological disorders in diabetes mellitus. J. Diabetes Sci. Technol. 2 (6), 1130-1138 (2008).
- Baskurt, O. K., Hardeman, M. R., Rampling, M. W., Meiselman, H. J. . Handbook of Hemorheology and Hemodynamics. , (2007).
- Lindqvist, T. The viscosity of the blood in narrow capillary tubes. Am. J. Physiol.-Legacy Content. 96, 562-568 (1931).
- Goldsmith, H. L., Cokelet, G. R., Gaehtgens, P. R. Fåhraeus: Evolution of his concepts in cardiovascular physiology. Am. J. Physiol. 257 (3), H1005-H1015 (1989).
- Fåhraeus, R. The suspension stability of the blood. Physiol. Rev. 9 (2), 241-274 (1929).
- Bauersachs, R. M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J. Determination of specific red blood cell aggregation indices via an automated system. Clin. Hemorheol. 9 (1), 1-25 (1989).
- Hardeman, M. R., Dobbe, J. G., Ince, C. The laser-assisted optical rotational cell analyzer (lorca) as red blood cell aggregometer. Clin. Hemorheol. Microcirc. 25 (1), 1-11 (2001).
- Rampling, M. W. Red cell aggregation and yield stress. Clinical Blood Rheology. , (1988).
- Dusting, J., Kaliviotis, E., Balabani, S., Yianneskis, M. Coupled human erythrocyte velocity field and aggregation measurements at physiological haematocrit levels. J. Biomech. 42 (10), 1438-1443 (2009).
- Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity: modelling using shear fields measured by a µPIV based technique. Med. Eng. Phys. 33 (7), 824-831 (2011).
- Sherwood, J. M., Kaliviotis, E., Dusting, J., Balabani, S. Spatial variation of blood viscosity and velocity distributions of aggregating and non-aggregating blood in a bifurcating microchannel. Biomech. Model. Mechan. 13 (2), 259-273 (2014).
- Chen, S., Barshtein, G., Gavish, B., Mahler, Y., Yedgar, S. Monitoring of red blood cell aggregability in a flow chamber by computerized image analysis. Clin. Hemorhol. Microcirc. 14 (4), 497-508 (1994).
- Xia, Y. N., Whitesides, G. M. Soft lithography. Angewandte Chemie International Edition England. , 551-577 (1998).
- Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Design of a microfluidic system for red blood cell aggregation investigation. J. Biomech. Eng. 136 (6), 064501-1-064501-5 (2014).
- Pitts, K. L., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry for velocity profile measurements of micro blood flows. J. Vis. Exp. (74), e50314 (2013).
- Bitsch, L., Oleson, L. H., Westergaard, C. H., Bruus, H., Klank, H., Kutter, J. P. Micro particle-image velocimetry of bead suspensions and blood flows. Exp. Fluids. 39 (3), 507-513 (2005).
- Wereley, S. T., Gui, L., Meinhart, C. D. Advanced algorithms for microscale particle image velocimetry. AIAA J. 40 (6), 1047-1105 (2002).
- Nguyen, C. V., Fouras, A., Carberry, J. Improvement of measurement accuracy in micro PIV by image overlapping. Exp. Fluids. 49 (3), 701-712 (2010).
- Pitts, K. L., Mehri, R., Mavriplis, C., Fenech, M. Micro-particle image velocimetry measurement of blood flow: validation and analysis of data pre-processing and processing methods. Meas. Sci. Technol. 23 (10), 105302 (2012).
- Bhamare, M. G., Patil, D. S. Automatic blood cell analysis by using digital image processing: a preliminary study. Int. J. Eng. Res. Tech. 2 (9), 3135-3141 (2013).
- Maitra, M., Gupta, R. K., Mukherjee, M. Detection and counting of red blood cells in blood cell images using hough transform. Int. J. Comput. Appl. 53 (16), 18-22 (2012).
- Jambhekar, N. D. Red blood cells classification using image processing. Sci. Res. Repot. 1 (3), 151-154 (2011).
- Otsu, N. A threshold selection method from gray-level histograms. IEEE Trans. Syst. Man. Cybern. 9 (1), 62-66 (1979).
