Ambiente Microfluidic controlada de Investigação dinâmico de Agregação Glóbulo Vermelho

Summary

O protocolo descrito detalhes um procedimento experimental para quantificar glóbulos vermelhos (RBC) agregados sob uma velocidade de corte constante e controlado, com base em técnicas de processamento de imagem. O objetivo deste protocolo é relacionar RBC tamanhos agregados à taxa de corte correspondente em um ambiente controlado microfluídico.

Abstract

O sangue, como biofluid não-newtoniano, representa o foco de numerosos estudos no campo hemorreologia. Constituintes do sangue incluem os glóbulos vermelhos, glóbulos brancos e plaquetas, que são suspensos em plasma sanguíneo. Devido à abundância das hemácias (40% a 45% do volume do sangue), o seu comportamento dita o comportamento reológico de sangue especialmente na microcirculação. Com taxas de corte muito baixos, hemácias são vistos de montar e entidades de formulário chamado agregados, o que faz com que o comportamento não-newtoniano de sangue. É importante compreender as condições da formação de agregados de compreender a reologia do sangue na microcirculação. O protocolo aqui descrito detalhes do procedimento experimental para determinar quantitativamente os agregados de RBC na microcirculação sob velocidade de cisalhamento constante, com base no processamento de imagem. Para este efeito, RBC-suspensões são testadas e analisadas em microcanais 120 x 60 mm de poli-dimetil-siloxano (PDMS). As suspensões são RBC-entchover usando um segundo fluido, a fim de obter um perfil de velocidade linear no interior da camada de sangue e, assim, obter uma grande gama de velocidades de cisalhamento constante. A velocidade de corte é determinada usando um sistema de micro partículas velocimetria de imagens (μPIV), enquanto agregados RBC são visualizados utilizando uma câmara de alta velocidade. Os vídeos capturados dos agregados RBC são analisados ​​usando técnicas de processamento de imagem, a fim de determinar os tamanhos de agregados com base nas intensidades de imagens.

Introduction

As células vermelhas do sangue (RBC) desempenham um papel crucial na determinação do comportamento reológico de sangue. Eles são quase singularmente responsável pelas propriedades particulares do sangue in vitro e in vivo. Sob condições fisiológicas, os glóbulos vermelhos ocupar 40% a 45% do volume de sangue. Na microcirculação, hemácias só ocupam até 20% do volume de sangue devido ao diâmetro dos vasos menores e o plasma efeito ^uma desnatação. Este fenómeno de redução de plasma na microcirculação é conhecido como o efeito Fåhraeus. Em baixas velocidades de corte, os glóbulos vermelhos são capazes de transpor em conjunto e formam um dimensional ou estruturas tridimensionais chamados "rouleaux" ou agregados, por conseguinte, contribuir para o comportamento não newtoniano do sangue. No entanto, o mecanismo de agregação de RBC não é completamente compreendido. Existem duas teorias para modelar a agregação de hemácias: a ponte da teoria células devido à ligação cruzada das macromoléculas ² ea atrac vigorteoria ção provocada pela depleção das moléculas, devido ao gradiente osmótico ^3.

Tipicamente, para o sangue humano, formar agregados com taxas de corte muito baixos ⁴ variando de 1 a 10 s ^-1. Acima dessa faixa, hemácias tendem a desagregar e fluxo separadamente dentro do vaso.

Compreender as condições da formação de agregados é de uma grande importância para o campo hemorreologia em termos de definir o comportamento reológico de sangue. Estes agregados são muitas vezes vistos a nível macrocirculação (> 300 mm de diâmetro) ^5. Nesta escala, o sangue é considerado como um fluido Newtoniano e de uma mistura homogénea. No entanto, estes agregados são raros no nível capilar (4-10 um de diâmetro) e são geralmente uma indicação de condições patológicas tais como a diabetes e a obesidade ^6. Outras condições patológicas que poderiam mudar a agregação RBC incluem condições inflamatórias ou infecciosas,doenças cardiovasculares, como hipertensão ou aterosclerose, doenças genéticas e doenças crônicas ^7. Portanto, a compreensão do mecanismo de agregação de glóbulos vermelhos e analisando estas entidades (por definição de uma relação entre o tamanho destes agregados e as condições de fluxo) pode conduzir à compreensão do comportamento microrheological de sangue e, portanto, relacioná-la com aplicações clínicas.

Agregados RBC pode ser alterada por vários factores tais como o hematócrito (volume de glóbulos vermelhos no sangue), a taxa de cisalhamento, o diâmetro do vaso, a rigidez da membrana de RBC e a composição do meio de suspensão ^8-10. Por conseguinte, são necessárias condições controladas, a fim de analisar de forma eficaz os agregados de RBC. Vários métodos são capazes de analisar a formação de agregados, fornecendo medições de agregação estáticos (índice de agregação) que oferece informações relevantes sobre o comportamento do sangue. Estes métodos incluem, inter alia, a taxa de sedimentação de eritrócitos¹¹ método, o método de transmissão ^de luz ^{de 12,} o método de reflexão de luz ¹³ e o método de baixa viscosidade de cisalhamento ^14.

Poucos estudos tentaram estudar a agregação de RBC e determinar o grau de agregação em condições de fluxo controladas ^15-17. No entanto, estes estudos indirectamente investigar RBC tamanhos de agregados por meio da determinação da relação entre o espaço ocupado em um sistema de corte medida com base em imagens microscópicas sanguíneos que fornecem informação sobre o grau de agregação, bem como a viscosidade local.

Nós, portanto, apresentar um novo procedimento para quantificar directamente RBC agrega na microcirculação, de forma dinâmica, com taxas de corte controlado e constante. Rbc suspensões são arrastadas, num duplo Y-microcanal (tal como ilustrado na Figura 1), com uma solução salina tamponada com fosfato (PBS), criando assim um fluxo de cisalhamento na camada de sangue. Dentro desse sangue camada uma constante de karitétaxa R pode ser obtido. Os RBC-suspensões são testados em hematócrito diferentes (H) níveis (5%, 10% e 15%) e sob taxas de deformação diferentes (2-11 seg ^-1). A velocidade do sangue e velocidade de cisalhamento são determinados usando um sistema de micro partículas velocimetria de imagens (μPIV), enquanto que o fluxo é visualizada utilizando uma câmara de alta velocidade. Os resultados obtidos são, então, processados ​​com um código MATLAB com base nas intensidades de imagem, a fim de detectar as hemácias e determinar os tamanhos de agregados.

Protocol

O sangue é coletado de indivíduos saudáveis ​​com a aprovação do comitê de ética da Universidade de Ottawa (H11-13-06). 1. Microchannel Fabrication Os microcanais são fabricados com base nos métodos de fotolitografia padrão 18. Projetar a geometria de microcanais utilizando um design de software assistida por computador (CAD) e imprimir a configuração em uma foto-máscara de transparência. Estas máscaras são cruciais, uma …

Representative Results

Um exemplo do fluxo de dois fluidos no duplo Y-microcanal é mostrado na Figura 2 para os glóbulos vermelhos humanos suspensos em 5%, 10% e 15% de hematócrito e fluindo a 10 ul / h. A Figura 3 mostra a diferença no tamanho dos agregados quando o fluxo no canal é reduzido de 10 l / h a 5 uL / ​​hr de um hematócrito de 10%. Isto dá uma noção qualitativa dos tamanhos dos agregados ao variar o hematócrito e da taxa de cisalhamento. A Figura 5 segue o deslocamen…

Discussion

Utilizando a presente metodologia, é possível analisar, qualitativamente e quantitativamente, o RBC agrega sob diferentes condições de fluxo e hematócritos. Para os testes de detecção de agregados e bem sucedida, é crucial para determinar a relação da velocidade adequada entre os dois fluidos com a entrada de microcanais. Esta relação é muito importante para se obter uma espessura de camada de sangue ideal onde o perfil de velocidade é quase-linear ^19.

Outro fator fu…

Materials

SU8-50 epoxy based negative Photo-resist	MicroChem Corp.
SU8-50 developer	MicroChem Corp.
Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184	Dow-Corning	3097358-1004
PE-50 series Plasma system	Plasma Etch	PE-50 series
Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)	FisherSci	B367861
Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2	Thermo Scientific	004260F
Poshpate buffered saline (PBS)	Sigma Aldrich	P5368-10PAK
Tracer fluorescent particles solution (15 mL)	FisherSci	R800
Aggregometer	RheoMeditech	Rheo Scan AnD300
Glass syringes (50 µL)	Hamilton	80965
Tubing (Tygon)	FisherSci	AAA00001
High speed camera (Basler)	Graftek Imaging Inc.	basler acA2000-340km	A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used.
Double pulsed camera	LaVision	Imager Intense
Microscope MITAS	LaVision	MITAS
Nd:YAG laser	New Wave Research	Solo-II
Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus)	Chemyx Inc. and Harvard Apparatus	Nexus3000 and PicoPlus
DaVis software	LaVision	Davis