Протокол, описанный подробности экспериментальную процедуру количественного Красный клеток крови (эритроцитов) агрегаты в контролируемой и постоянной скоростью сдвига, на основе методов обработки изображений. Целью данного протокола является отношение RBC размеры агрегатные к соответствующей скорости сдвига в контролируемой среде микрожидком.
Кровь, как неньютоновской биожидкости, представляет собой фокус многочисленных исследований в области гемореологии. Компонентов крови включают красные кровяные клетки, белые кровяные клетки и тромбоциты, которые взвешенных в плазме крови. Из-за обилия эритроцитов (от 40% до 45% от объема крови), их поведение диктует реологические свойства крови, особенно в микроциркуляции. При очень низких скоростях сдвига, эритроциты видел, чтобы собрать и форма лица называется агрегатов, что приводит к неньютоновской поведение крови. Важно понять условия формирования агрегатов понять реологические свойства крови в микроциркуляции. Протокол, описанный здесь подробно экспериментальную процедуру, чтобы определить количественно агрегатов эритроцитов в микроциркуляции под постоянной скорости сдвига, на основе обработки изображений. Для этой цели RBC-суспензии испытаны и проанализированы в 120 х 60 мкм поли-диметил-силоксан (PDMS) микроканалов. РБК-суспензий ЛОРдождь с использованием второй текучей среды, чтобы получить линейный профиль скорости в слое крови и, таким образом, достичь широкого спектра постоянных скоростях сдвига. Скорость сдвига определяется с помощью микро Velocimetry Particle Image (μPIV) системы, в то время как РБК агрегаты визуализированы с помощью высокоскоростной камеры. В видеозаписи, сделанные из агрегатов эритроцитов проанализированы с использованием методов обработки изображений, чтобы определить совокупные размеры, основанные на интенсивности изображений.
Красные клетки крови (эритроцитов) играют решающую роль в определении реологические свойства крови. Они почти сингулярно ответственность за особых свойств крови в пробирке и в естественных условиях. В физиологических условиях, эритроциты занимают от 40% до 45% от объема крови. В микроциркуляции, только БС занимать до 20% объема крови за счет меньшего диаметра сосудов и плазме скользя эффекта 1. Это явление снижения плазмы в микроциркуляции известно как эффект Fåhræus. При низких скоростях сдвига, эритроциты способны преодолеть вместе и образуют одномерное или трехмерные структуры, называемые "неустойчивых агрегатов эритроцитов" или агрегаты, следовательно, вносит свой вклад в неньютоновской поведение крови. Тем не менее, механизм агрегации эритроцитов не полностью изучены. Две теории существуют для моделирования агрегацию эритроцитов: мостиковых теории клеток из-за сшивки макромолекул 2 и сила привлеТеория ние вызвано истощение молекул в результате осмотическому градиенту 3.
Как правило, для человеческой крови, агрегаты образуются при очень низких скоростях сдвига 4 в пределах от 1 до 10 с -1. Выше этого диапазона, эритроциты, как правило, дезагрегации и потока отдельно в сосуде.
Понимание условий образования агрегатов имеет большое значение для области гемореологии с точки зрения определения реологических свойств крови;. Эти агрегаты часто видели на уровне макроциркуляционного (> диаметром 300 мкм) 5. В этом масштабе, кровь считается ньютоновской жидкости и однородной смеси. Тем не менее, эти агрегаты редко можно увидеть в капиллярном уровне (4-10 мкм в диаметре) и, как правило, свидетельствует о патологических состояний, таких как диабет и ожирение 6. Другие патологические состояния, которые могут изменить агрегации РБК включают воспалительные или инфекционные условия,сердечно-сосудистые заболевания, такие как гипертония или атеросклероз, генетических нарушений и хронических заболеваний. 7 Таким образом, понимая, что механизм агрегации эритроцитов и анализа этих объектов (путем определения отношения между размером этих агрегатов и условий потока) может привести к пониманию микрореологических поведения крови и, следовательно, отношение его к клинической практике.
RBC агрегаты могут быть изменены с помощью нескольких факторов, таких как гематокрита (объема эритроцитов в крови), скорость сдвига, диаметра сосуда, в жесткости мембраны эритроцитов и суспендирующей среды состава 8-10. Таким образом, контролируемые условия необходимы для того, чтобы эффективно анализировать агрегаты РБК. Некоторые методы способны анализировать совокупную образование путем предоставления статических измерений агрегации (индекс агрегации), который предлагает соответствующую информацию о поведении крови. Эти методы включают в себя, в частности, скорость оседания эритроцитовМетод 11, способ передачи света 12, метод отражения света 13 и 14 Способ вязкость низкой скорости сдвига.
Несколько исследований пытались изучать агрегацию эритроцитов и определить степень агрегации в контролируемых условиях потока 15-17. Тем не менее, эти исследования косвенно исследовать РБК совокупные размеры, определяя отношение занятого пространства в системе сдвига измеряется на основе микроскопических изображений, обеспечивающих крови информацию о степени агрегации, а также местного вязкости.
Поэтому мы представляем новую процедуру непосредственно количественно РБК агрегатов микроциркуляции, динамично, в контролируемых и постоянных скоростях сдвига. RBC-суспензии увлекаются, в двойной Y-микроканала (как показано на рисунке 1), с фосфатным буферным солевым раствором (PBS), решение, следовательно, создания сдвигового течения в слое крови. В этой крови слой постоянный Шиаг ставка может быть получена. В RBC-суспензии тестировали при различной гематокрита (H) уровней (5%, 10% и 15%) и при различных скоростях сдвига (2-11 сек -1). Скорость крови и скорость сдвига определяется с использованием микро Velocimetry частиц изображения (μPIV) системы, а поток визуализировали с использованием высокоскоростной камеры. Полученные результаты затем обрабатываются с помощью кода MATLAB на основе интенсивности изображения для обнаружения БС и определять совокупные размеры.
С помощью настоящего методику, можно проанализировать качественно и количественно эритроцитов агрегатов при различных условиях потока и гематокрита. Для успешного тестирования и совокупного обнаружения, важно, чтобы определить соответствующий коэффициент скорости между двумя жидк…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана естественных наук и инженерного исследовательский совет Канады. Микротехнологий была выполнена при поддержке объекта МакГилл Nanotools Microfab в Университете Макгилла и кафедры электроники в Университете Карлтон.
SU8-50 epoxy based negative Photo-resist | MicroChem Corp. | ||
SU8-50 developer | MicroChem Corp. | ||
Poly(dimethylsiloxane) (PDMS) Sylgard-184 | Dow-Corning | 3097358-1004 | |
PE-50 series Plasma system | Plasma Etch | PE-50 series | |
Blood collection tubes with K2 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) | FisherSci | B367861 | |
Centrifuge, i.e. Thermo Scientific CL2 | Thermo Scientific | 004260F | |
Poshpate buffered saline (PBS) | Sigma Aldrich | P5368-10PAK | |
Tracer fluorescent particles solution (15 mL) | FisherSci | R800 | |
Aggregometer | RheoMeditech | Rheo Scan AnD300 | |
Glass syringes (50 µL) | Hamilton | 80965 | |
Tubing (Tygon) | FisherSci | AAA00001 | |
High speed camera (Basler) | Graftek Imaging Inc. | basler acA2000-340km | A camera capable of recording 18 frames per seconds could be used. |
Double pulsed camera | LaVision | Imager Intense | |
Microscope MITAS | LaVision | MITAS | |
Nd:YAG laser | New Wave Research | Solo-II | |
Syringe pump (Nexus3000 and PicoPlus) | Chemyx Inc. and Harvard Apparatus | Nexus3000 and PicoPlus | |
DaVis software | LaVision | Davis |