馬腱でテクネチウム-99m標識骨髄間葉系幹細胞のin vivoイメージングと追跡中
Summary
This protocol describes the radiolabeling of equine mesenchymal stem cells and their implantation into tendon injuries in the horse in order to determine cell survival and tissue distribution using gamma scintigraphy.
Abstract
馬での腱や靭帯損傷の治療のための骨髄間葉系幹細胞（BMMSC）の適用における最近の進歩は、実験的および臨床研究の両方でアウトカム指標が改善することをお勧めします。 BMMSCが大量に腱損傷に移植されていますが（通常は10から20000000細胞）、比較的少数が生き残る（<10％）、これらは、移植後までの5ヶ月間持続することができますが。これはBMMSCは、他の組織に移植されており、それは多くの人が最初の注入プロセスを生き残るためには、細胞が他の臓器にクリアされているかどうかをどのように、この損失が発生したときに理解することが重要である他の種における共通の観察であるように思われます。細胞の運命を追跡する前に細胞数のセルの位置と定量化のin vivoイメージングで非侵襲的に移植可能BMMSCを放射標識することによって達成することができます。
このプロトコルは、電池が記載さlabeli馬で負傷した屈筋腱にテクネチウム-99m（Tc-99m）、および移植後のこれらの細胞の追跡を使用していますngの手順。 Tc-99メートルは、ガンマ線を放射し、親油性化合物のhexamethylpropyleneamineオキシム（HMPAO）の存在下で細胞によって内在化することができ短命（6.01時間のT 1/2）同位体です。これらの特性は、多くの異なる疾患の診断のための核医学診療所での使用に最適です。標識された細胞の運命は、肺、甲状腺および他の器官への細胞の病巣と流通に保持された細胞の数の両方を定量化するためにガンマシンチグラフィーによって（36時間まで）短期的に続くことができます。この技術は、血液白血球の標識から適合され、他の臓器に移植BMMSC画像に利用することができます。
Introduction
病的または損傷組織の修復のための再生戦略は、組織のさまざまな由来の多能性幹細胞に基づいており、患部に注入されます。馬での腱や靭帯損傷の治療のための自家BMMSCの応用における最近の進歩は、両方の実験1-5で改善されたアウトカム指標および臨床研究6を示しています 。馬は、幹細胞に関連する治療の有効性を評価するための特に魅力的なモデルである、それは年齢に苦しんでいると遠位前肢の腱に関連した傷害を無理ので、それはアスレチック動物であり、それは大規模な、容易に骨髄の回復であり、正確な注入。腱損傷は、線維症に自然に治癒するが、癒さ腱7機能的に劣っていると再傷害8のリスクが高いです。それは弾性エネルギーとして機能するように進化してきたように浅指屈筋腱（SDFT）が最も一般的に影響を受けています店舗や経験の高負荷は、エネルギー効率、高速移動を達成するために強調しています。損傷後の機能を回復することは、非常に重要です。これらの損傷は、同様の機能9を行い 、ヒトにおけるアキレス腱に影響を与えるものと同様です。したがって、細胞ベースの再生戦略が成果を改善するために、再損傷を低減するために魅力的な機会を提供し、治療や、怪我のために良い修復を達成するためには良い治療法の選択肢はありません。
ほとんどの研究では5から20000000自家BMMSCは通常、したがって、細胞のための容器として機能する腱体のコア内に発生した病変に直接注入されています。一度注入された細胞の運命は、細胞を追跡するための、明確で異なる細胞標識法は、最近記載されているではありません。蛍光タグで標識された細胞は、比較的少数（<10％）10,11の中で生き残ることが示されました。蛍光ラベルが必要組織抽出と時間がかかり、容易に大規模な動物モデルまたは臨床例では、時間的分析を容易にしない組織学的分析のために切片。より最近の研究では、細胞を標識し、ガンマシンチグラフィー1によって彼らの運命を追跡するために放射性同位体99m Tcでを使用しています。この方法は、12動脈内または静脈内注射1,12経由頚静脈1または地域の灌流を介した静脈内、迅速な比較は病巣内などの細胞送達の異なる経路間で行うことを可能にします。細胞の持続性及び分布は、その後、種々の器官のガンマシンチグラフィーにより画像化することができます。これは、病巣内に注射された細胞のわずか24％が24時間で1病変に残り、これは他の研究実験を使用して作成された病変と同一の放射性標識5を使用してサポートされていることを実証しました。さらに、細胞はdelivere腱病変に家に限られた能力を示し、局所灌流によってDまたは静脈内投与が、後者の経路4によって肺に分散されます。
鉄ナノ粒子で標識されたBMMSCは前肢の腱13内に移植された細胞を追跡するための別の方法です。鉄ナノ粒子標識された細胞は、MRIによるインビボでの細胞の追跡を可能にするが、大型動物の経時研究は麻酔がMRIスキャンを実行するためのそれぞれの時点で投与することができる回数によって制限されます。また、鉄ナノ粒子は、腱の体内への標識細胞の移行に関する情報を制限し、MRI上の低強度です。使用できる他の放射性同位体は、インジウム-111を含むが、これはのTc-99メートル（2.8日対6.0時間）以上のガンマ線放射エネルギーよりも長い半減期の不利益を被ります。加えて、細胞生存率は、インジウム-111 14で標識されたときに減少することが報告されています。 TC-99メートルは、一方で、日常的にウマおよびヒトの両方の核に使用され薬は、末梢血単核細胞を標識し、シンチグラフィーにより生体内でそれらの分布に従うこと。これは、比較的容易に細胞へのTC-99メートル-HMPAOとして、テクネチウムを結合するためのリンカー分子としてHMPAOを用いて細胞に取り込ませることができます。 Tc-99メートル-HMPAOはBMMSCが良いの生存率を示し、 試験管 4 で増殖することができるラベルされました。このプロトコルは、前肢SDFTで天然に存在する病巣に移植ラベリングおよびウマ自家BMMSCの追跡を詳細に説明します。
これは、プロトコルが唯一の研究ツールとして使用することを意図していることに注意することが重要です。細胞表現型の放射性標識の効果が十分に解明されていないような臨床治療法としてのその使用は推奨されません。
Protocol
Representative Results
Discussion
骨髄に加えて、脂肪組織のような供給源から単離された幹細胞は、このプロトコルで標識化するのに適しています。また、凍結状態からの細胞を復活し、標識試験12のための所望の数に培養で増殖することができます。
BMMSCを標識の効率を決める重要な要因は、放射性薬局でのモリブデン発生器からのTc-99メートルの溶出の間の時間、のTc-99メートル-HMPAOの準備や…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge funding from the Horserace Betting Levy Board U.K. (grant number 721) and VetCell BioScience Ltd, U.K. and by Consejerìa de Innovaciòn, Ciencia y Empresa, Junta de Andalucìa, Spain.
Materials
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 h of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec – Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18G and 19G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18G); NN1938R (19G) | |
| Syringes 1 mL and 2 mL | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 mL); SYR6003 (2 mL) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 mL | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS – Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
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