Abstract
Последние достижения в применении мезенхимальных стволовых клеток костного мозга (BMMSC) для лечения сухожилий и связок травмы в коня предлагаю улучшения исхода меры в обоих экспериментальных и клинических исследований. Несмотря на то, BMMSC имплантируют в сухожилия поражения в больших количествах (обычно 10 - 20 млн клеток), только относительно небольшое число выжить (<10%), хотя они могут сохраняться до 5 месяцев после имплантации. Это, как представляется, общее наблюдение у других видов, где BMMSC были имплантированы в другие ткани, и это важно понимать, когда это происходит потеря, сколько выдержит начальный процесс имплантации и ли клетки будут очищены в другие органы. Отслеживание судьбу клетки может быть достигнуто путем радиоактивной метки в BMMSC до имплантации, которая позволяет неинвазивным в естественных изображений расположения клеток и количественного определения числа клеток.
Этот протокол описывает клеток labeliПроцедура нг, который использует технеция-99m (Тс-99m), и отслеживание этих клеток после имплантации в поврежденный сухожилий сгибателей в лошадей. Tc-99m является кратковременным (т 1/2 от 6,01 ч) изотопом, который испускает гамма-лучи и может быть усвоены клеток в присутствии липофильное соединение hexamethylpropyleneamine оксима (HMPAO). Эти свойства делают его идеальным для использования в клиниках медицины ядерных для диагностики многих различных заболеваний. Судьба меченых клеток можно проследить в краткосрочной перспективе (до 36 ч) по гамма-сцинтиграфии количественного и число клеток, удерживаемых в поражении и распределения клеток в легких, щитовидной железы и других органов. Этот метод адаптирован из маркировки лейкоцитов крови и могут быть использованы для изображения имплантированного BMMSC в других органах.
Introduction
Регенеративные стратегии для ремонта больных или поврежденных тканей основаны на мультипотентных стволовых клеток, полученных из различных тканей и имплантированных в пораженной области. Последние достижения в применении аутологичных BMMSC для лечения сухожилий и связок травмы в лошади показали улучшенные итоговые меры в обеих экспериментальных 1-5 и клинические исследования 6. Лошадь является особенно привлекательной моделью для оценки эффективности стволовых клеток, связанную лечения, потому что он страдает от возраста и надрываться, связанные травмы сухожилий дистального передних конечностей, это спортивная животных, и это большой, облегчая восстановление костного мозга и точная имплантация. Сухожильные травмы заживают естественно, с фиброзом, но исцелил сухожилия функционально уступает 7 и имеет высокий риск повторной травмы 8. Поверхностный цифровой сухожилия сгибателей (SDFT) наиболее часто поражаются, как она развивалась, чтобы действовать в качестве упругой энергиимагазин и опыт высокое содержание подчеркивает достижения энергоэффективных и высокоскоростной передвижения. Восстановление функции после травмы, поэтому решающее значение. Эти травмы аналогичны тем, которые влияет на Ахиллово сухожилие в организме человека, который выполняет ту же функцию 9. Там нет хороших методов лечения для лечения или достижения хороший ремонт для таких травм, поэтому на основе клеток регенеративные стратегии предлагают привлекательную возможность для улучшения результатов и уменьшить повторную травму.
В большинстве исследований 5 - 20 млн аутологичных BMMSC вводят непосредственно в очаг, который, как правило, происходят в ядре тела сухожилия, которые, следовательно, выступает в качестве сосуда для клеток. Судьба клеток вводили один раз не ясно, и различные методы мечения клеток, чтобы отслеживать клетки были описаны в последнее время. Клетки, меченные флуоресцентной меткой в были показаны, чтобы выжить только в относительно небольших количествах (<10%) 10,11. Флуоресцентные метки требуютизвлечение тканей и секционирования для гистологического анализа, который требует много времени и не легко облегчить временной анализ в значительной животной модели или в клинических случаев. В более поздней работе мы использовали радиоизотопный 99m Tc маркировать клетки и следить за их судьбу с помощью гамма сцинтиграфии 1. Этот метод позволяет быстро проводить сравнения между различными маршрутов доставки клеток, в том числе в очаг поражения, внутривенных через яремную вену 1 или региональной перфузии через внутри артериальных 12 или внутривенных инъекций 1,12. Сохранение и распространение клеток, то могут быть отображены с помощью гамма-сцинтиграфии различных органов. Это продемонстрировало, что только 24% клеток вводили intralesionally оставались в поражении на 24 часов 1, и это поддерживается другом исследовании с использованием экспериментально созданные поражений и с использованием того же радиоактивную 5. Кроме того, клетки показывают ограниченную способность к дому в сухожилие, когда поражений delivereD региональной перфузии или внутривенно, но разошлись в легкие последним маршрутов 4.
BMMSC помечены наночастиц железа является альтернативным методом для отслеживания клетки, имплантированные в передних конечностей сухожилий 13. Хотя железа наночастиц меченые клетки позволяет отслеживать клеток в живом организме с помощью МРТ, временные исследования в значительной животного ограничены количество раз анестезии можно вводить в каждый момент времени для выполнения сканирования МРТ в. Кроме того, наночастицы железа в hypointense на МРТ, которая ограничивает информацию о миграции меченых клеток в организм сухожилия. Другие радиоизотопы, которые могут быть использованы, включают индий-111, но это страдает тем недостатком, более длительный период полураспада, чем Tc-99m (2.8 дней против 6,0 ч) и более высокую энергию излучения гамма-. Кроме того, жизнеспособность клеток, как сообщалось, быть уменьшено, если помечены индий-111 14. Tc-99m, с другой стороны, обычно используется в обоих лошадей и человека ядерногомедицина маркировать одноядерные клетки периферической крови и следить за их распространение в естественных условиях по сцинтиграфии. Это может быть относительно легко поглощается клетками с использованием в качестве HMPAO линкерной молекулы для связывания технеций, а Tc-99m-HMPAO, к клеткам. Тс-99m-HMPAO помечены BMMSC показать хорошую жизнеспособность и могут размножаться в пробирке 4. Этот протокол детали маркировки и отслеживания лошадей аутологичных BMMSC имплантированный в природе поражений в передних конечностей SDFT.
Важно отметить, что протокол предназначен только для использования в качестве исследовательского инструмента. Его использование в качестве клинического лечебного воздействия не рекомендуется, поскольку эффект радиоактивной метки на клеточного фенотипа имеет полностью не выяснены.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Случаи, описанные здесь, были выполнены следующие этического разрешения, предоставленного по этике и благосостояния комитета животное Коллегия де Veterinarios де Малага, Испания, и Королевского ветеринарного колледжа, Северной Mymms, Великобритания процедур, используемых на лошадях по основаны на утвержденных протоколов, которые используется в клинике на лошадях, получающих терапию на основе стволовых клеток, который включает седативный эффект, стремление костного мозга, внутри- сухожильный инъекции, региональной перфузии, внутривенную инъекцию, после процедурный лечения и боли управления и мониторинга после имплантации.
1. Основные меры, принимаемые в заранее
- Ищите институциональных этики и утверждение благосостояния животных и придерживаться требований местного законодательства до начала работы.
- Ищите институциональной одобрение для работы с ионизирующим излучением, как диктуется местными и правовых норм, включая соответствующий уровень защиты персонала и окружающей среды и утилизации CONTAMство между отходов.
- Используйте следующие критерии включения: лошадей, присутствующие с не-травматического повреждения перенапряжения (Tendinopathy или поражение связок) к поверхностным сгибателей цифровой сухожилия передней конечности и повреждениями в результате дефекта в сухожилия и дефекта в окружении неповрежденной сухожилия и / или рыхлая ткань вокруг сухожилия ,
Примечание: обследование и диагностика таких травм и клинической подготовки лошадей для клеток имплантации был подробно в другом месте 6,15.
Примечание: Выделение и расширения в культуре BMMSC получены из костного мозга лошадей был подробно ранее 6,16. Текущий протокол для инъекций BMMSC для SDFT травм в лошадь использует 10 миллионов клеток на мл 4 супернатанта мозга костей аутологичных (BMS) 16. - Используйте клетки, которые не подверглись не более 4 места для имплантации в естественных условиях, чтобы избежать потенциального клеточного фенотипа или генетические изменения, связанные с высоким числом пассажей Слоктей.
- Доставка необходимого количества клеток в BMS (в пределах 24 ч в чилл поле в 4 - 8 ° С) в ветеринарной клинике, где клетка имплантация должна быть выполнена.
Примечание: клиническое использование мезенхимальных стволовых клеток в супернатант костного мозга является запатентованная процедура принадлежит ReCellerate Inc (США) и его использование может потребовать разрешения.
Примечание: Тс-99m является гамма-излучателем (140 кэВ) с относительно коротким периодом полураспада (6,0058 ч, поэтому почти 94% из них распадается на ее стабильной форме 99 Тс в 24 часов). Гамма энергия делает его пригодным для детектирования гамма-камер (сцинтиграфических) и коротких результатов полураспада в очень ограниченное время радиационного облучения на как лошадь и обработки животных персонала. Этот протокол описывает на месте маркировки клеток с использованием Tc-99m-HMPAO [HMPAO меченного Tc-99m (как пертехнетатом натрия)]. - Заказ Tc-99m свежий от поставщика, так что он будет доставлен и используется для маркировки клеток умгин 2 ч элюции от генератора Tc-99m. Убедитесь, что Тс-99m поставляется в 1 ГБк в стандартном буфере (поставщика) 1 мл раствора.
- Используйте все буферы при комнатной температуре. Выполните процедуру маркировки, имплантация клеток и изображений (гамма-сцинтиграфии) в изотопной сдерживания комнату со всем оборудованием протирать спиртом салфетки до начала работы.
2. Подготовка лошади и УЗИ передней лапы сухожилия
- Запись УЗИ на первом поступлении на травмы (когда костный мозг атмосферный), а затем в момент времени, когда радиоактивно меченные клетки вводятся.
- Выполните УЗИ и клеток имплантации с лошади подшипник вес равномерно в ларьке и под стоя седации (вместо общей анестезии). Администрирование седативный эффект, используя смесь HCl и детомидина буторфанола тартрат, каждый на 0,01 до 0,02 мг / кг внутривенно.
Примечание: Восстановление быстрый и после хирургического лечения не требуетособые соображения. - После периневральная анестезия применяется (шаг 2.6) в пораженной конечности, держать лошадь на станции под наркозом, чтобы уменьшить движение лошади во время лечения. Визуально проверьте соответствующий уровень седации судить из нижнего положения головы и поведение лошади и лошадь комфортно во время инъекции клеток и движений гамма-камеры во время приобретения сцинтиграфических изображений.
Примечание: Это не нужно применять мазь ветеринар на глазах (для предотвращения сухости), потому что под наркозом миганием не влияет, и лошадь способна поддерживать гидратацию глаз. Мониторинг после имплантации клеток является неинвазивным (УЗИ и сцинтиграфия гамма). - Клип тесно волосы вышележащие сухожилия (с лошади стрижки волос), то чистить обрезанную область, используя комбинацию хлоргексидина хирургического скраб и, наконец, алкоголя.
- Применить акустический гель сцепления на площадь исканирования методично записывать сканирование полного ладонной пястной области, последовательно меченых уровни 1 - 7 17, с линейным датчиком (12 МГц или аналогичный), чтобы получить серийный на-падения поперечные и продольные изображения. Сохранения изображений в цифровой форме так, чтобы площадь поперечного сечения, а максимальная зона травмы 4 могут быть получены с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
- Подготовьте область, лежащую ладонной нервы сразу дистальнее запястья для асептического инъекции местного анестетика, чтобы обеспечить полное десенсибилизации кожи, покрывающей сухожилие и поверхностную цифровой сухожилия сгибателей. Вводите 2 мл подкожно mepivicaine как и рядом с ладонной нервов (в их югу-фасциальных месте) между сухожилиями сгибателей и связка сразу дистальнее запястья на обеих сторонах конечностей.
- После того, как предварительный сканирования была выполнена имплантация подготовить сайт, очистки области с хлоргексидином хирургических хcrub решение, по крайней мере 5 мин и, наконец, спирт пропитанной марли. Выполните все последующие шаги в асептической моды.
3. Тс-99m-маркировка лошадей мезенхимальных стволовых клеток
Примечание: Шаги к маркировке клетка может быть выполнена во время УЗИ передней конечности, как это будет минимизировать изотопов распада между маркировки клеток и имплантации меченых клеток в сухожилия.
- Снимите BMS из клеток, поскольку это мешает поглощение изотопа. Чтобы сделать это, извлечь флакон BMMSC (10 млн клеток в 1 мл BMS) из коробки охлаждающего и осаждения клеток в микроцентрифуге при 350 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Осторожно удалите супернатант с 18G 19G или игла (прилагается к 2 мл шприц), оставляя небольшое падение (≤ 0,1 мл) в трубке, чтобы помочь клеток ресуспендирования. Сохранить супернатант (главный экран измерений) в стерильной микроцентрифужных трубки и держать на льду для последующего повторного использования.
- Ресуспендируют клеток в остаточной капли супернатанта FLIcking трубку осторожно пальцами (а не вихря) и оставить трубку в стойку при комнатной температуре. Убедитесь, что клетки полностью ресуспендировали и что нет никаких видимых комков клеток.
- Подготовка Tc-99m следующим образом. Передача 1 мл технеция Pertechnetate в пузырек HMPAO с помощью шприца 1 мл и иглы. Осторожно перемешать, но тщательно и оставьте на 5 мин за свинцовой защиты. Примечание: Этот шаг может быть сделано в то время как клетки вращаются в шаге 2.1.
- Добавить все Тс-99m-HMPAO смеси с помощью шприца 1 мл и иглу для клеток и аккуратно перемешать. Инкубировать в течение 30 мин при комнатной температуре за свинцовым экраном.
- Для следующих шагов, используйте щипцы (или папиросную бумагу), чтобы открыть крышку микроцентрифужных трубки, чтобы минимизировать изотопов загрязнения (в перчатке) пальца и затем другое оборудование. Используйте шприц 2 мл и 21 г иглы для добавления или удаления промывочного буфера.
Примечание: Использование поля изотопов монитора рекомендуется следить за загрязнение поверхностей и оборудования. Добавить 1 мл PBS в смеси Тс-99m-HMPAO-клеток, закрыть крышку, аккуратно перемешать и спина для осаждения клеток, как в шаге 3.1. - Осторожно снимите PBS в новую пробирку (спасти это за свинцовой защиты и этикетки как W1). Ресуспендируют осадок клеток в 1 мл свежей PBS. Центрифуга трубки и удалить супернатант, как описано выше (за исключением этого и этикетки, как W2).
- Рассчитывают эффективности маркировки путем измерения счетчики в W1 и W2 труб и клеточного осадка. Сделайте это путем размещения каждый труб в скважине изотопа дозы калибратора прибора и записи радиоактивности как импульсов в минуту (СРМ). Рассчитать эффективность маркировке (радиоактивность, как CPM клеток) / (радиоактивность клеток супернатант +) х 100.
- Ресуспендируют клетки тщательно в остаточном PBS, а затем добавить БМС спасены от шага 3.1. Клетки готовы к внутриочагового имплантации.
4. Имплантация Тс-99m-HMPAO-меченых клеток
- Intralesional имплантацияв сухожилия под ультразвуковым контролем
- Медленно ввести 1,5 или 2 дюйма (50 мм) 20 г иглы в максимально зоне травмы поражения в продольной ориентации с ультразвуковым преобразователем, покрытой в стерильной драпировки, в соответствии с иглой так, что длина иглы может быть идентифицированы ultrasonographically и кончик если игла точно расположен в центре поражения.
- Использование соответствующего экранирования, сбора клеток в 2 мл шприца (Луера, чтобы свести к минимуму риск загрязнения и внешнего в свинцово-экранированный шприц крышкой) с использованием 20 G иглу. Откажитесь от иглы, стараясь не терять жидкость. Теперь приложите шприц с меченых клеток на иглу предварительно находится в сухожилии.
- Поместите ультразвукового зонда под иглой так, чтобы игла тракта в ткани отчетливо видна. Вводите клеток при медленном, но устойчивом темпе в поражении. Убедитесь, что нет устойчивость к инъекции. Если это встречаетсятщательно перемещать иглу под ультразвуковым контролем. Убедитесь, что жидкость выброса в поражении видна на изображении ультразвука в безэховой жидкости, содержащей пузырьки воздуха гиперэхогенных.
- Вывести иглы и сразу поместить давление на игольного отверстия, чтобы предотвратить потерю вводили клетки и свести к минимуму распространение изотопа по наружной поверхности конечности. Сразу одеваться конечность с одним слоем autoadhesive повязку. Лошадь готова к гамма-сцинтиграфии. Немедленно выполнить эту.
Примечание: После введения клеток в сухожилии, приобретают количество пустого шприца и иглы, чтобы оценить возможное прямые потери клеток, которые могут остаться в шприце.
- Региональная перфузия Тс-99m-HMPAO-меченых клеток
- Выполните шаг 2.4.
- Нанесите 100 мм резиновая жгут повязкой на ближнем пясти с двумя 100 мм хлопка рулона марлевой повязкой, расположенной медиально и латерально.
- Соблюдая правила асептики, подготовить тысэлектронной кожи по боковой ладонной цифровой вены на уровне боковой проксимальной сесамовидной кости путем промывки области с хлоргексидином хирургической скраб раствор по меньшей мере 5 мин и, наконец, марлей, смоченной в спирте. Выполните все последующие шаги в асептической моды.
- Подготовьте расширение 100 мм комплект с 21 G х ¾ "(0,8 х 19 мм) бабочка иглы для венепункции, заполнив гепаринизированным стерильным физиологическим раствором, а затем ввести иглу в боковую ладонной цифровой вены. После того, как вена вводится кровь частично заполнить набор расширений. На разъеме замка Luer прикрепить люэровского резиновый колпачок для облегчения последующей инъекции меченых клеток.
- Развести МСК в 19 мл PBS путем сбора клеток в 20 мл шприц с предустановленной PBS. Применить клетки с помощью резиновой чашки с использованием 18 г (1,2 х 40 мм) иглы для подкожных инъекций в медленном, но постоянной скоростью (30 - 40 сек). Промойте катетер 1 мл PBS предустановленной в Syringе.
- Удалить иглу и сразу же применить давление на кожу над игольного отверстия со слоем пяти 4 х 4 хлопковых сеток. Затем поместите легкий повязку с эластичным клеем на проксимальной области сесамовидной и оставить жгут на месте в течение 30 мин после инъекции.
- Отпустите жгут после 30 мин. Лошадь готова к гамма-сцинтиграфии.
Примечание: После инъекции клеток, приобретают количество пустого шприца и иглы, чтобы оценить возможное прямые потери клеток, которые могут остаться в шприце.
5. Гамма Сцинтиграфия
- Сцинтиграфия изображения
- Приобретение плоской сцинтиграфии изображения с гамма-камеры (установленной на 140 кэВ фотоэлектрического пика с использованием 20% симметричную окно), снабженный низкой энергии, коллиматора параллельно отверстие.
- Получить все изображения после времени 0 стоять лошадей седации, как в шаге 2.2. После времени 0 сцинтиграмме, замените света повязку над имплантации сит.е с мягкой повязкой. Удалить эту повязку перед каждым сцинтиграфия экзамена.
- Приобретать статические изображения в течение 60 сек каждый (256 256) матрицы, используя программное обеспечение для обработки с "приобретают" - "Выбор исследование" - "кости" статические варианты. Очень важно, чтобы лошадь не перемещается в течение периода захвата изображений, поскольку параметр статический режим не имеет модуль для коррекции движения.
- Для внутриочагового инъекции, получить боковые изображения из области поражения от запястья до дистального конечности, эквивалентная площадь контралатеральной конечности, левой области легких и левой щитовидной железы. При приобретении передних конечностей изображений, установите ведущую экран между ног, чтобы избежать визуализации конечностей контралатеральном. Получение образов изображений на 5 мин после инъекции (0 времени), а затем в 1, 3, 6, 12, 24, 36 и 48 ч.
- Для регионального перфузии, получить боковые и спинные гамма изображения, как и для 5.1.1.3. Получение изображений 5 мин AFтер жгут релизе. Это будет время 0. Это может быть полезно, чтобы изображение конечности сразу после введения клеток для оценки рассчитывает до жгут освобождения. Получение гамма изображений 1, 3, 6, 12, 24, 36 и 48 ч после введения клеток.
- После того, как изображения были приобретены, процесс изображения вручную с помощью "обработки" вариант программного обеспечения с выбранными опциями для "Соколов" цвета и "Инверсия" цвета. Затем выберите "область интереса" (ROI) и "эллипс", так как это позволяет перепрофилирование маски выбора и передвижения по площади поражения. Получите насчитывает более КОРОЛЯ, выбрав опцию "Добавить в статистике". Убедитесь, что одинакового размера регионы процентной (ROI) записанные для каждого животного в различных временных точках.
- Далее, исправить счетчики для предсказанного распада технеция в каждый момент времени. Используйте следующее уравнение для коррекции распада:А = А о е - (0.693t / Т 1/2), где А о начальная активность изотопа, А распад исправлены радиоактивности в нулевой момент времени, т является время, прошедшее и Т 1/2 составляет половину -Жизнь изотопа. Затем выразить исправленные отсчеты в каждый момент времени в процентах от ROI в момент времени 0 выработать процент клеток, оставшихся, используя следующую формулу:
- Приобретение плоской сцинтиграфии изображения с гамма-камеры (установленной на 140 кэВ фотоэлектрического пика с использованием 20% симметричную окно), снабженный низкой энергии, коллиматора параллельно отверстие.
% клеток, оставшихся (т) = 100 - {[(предсказывали распад (т) - распад (т)) / предсказывал распад (т)]} х 100
распада (т) = ROI (т) / ROI (0) х 100.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Тс-99m-HMPAO включение в BMMSs не отрицательно влияет на их способность прилипать к тканевой культуры пластика и в то время как они показывают способность оружия к образованию монослоя (рис 1) мы не полностью определена ли затронуты темпы пролиферации или другие клеточные фенотипы. Их морфология аналогична немеченого клеток с типичной формой шпинделя. Эффективность сотовой маркировка (т.е.., Поглощение этикетке), обычно варьирует от 1,5% до 25%. Основной причиной низкой эффективности мечения была связана с задержкой в доставке 99m Tc в клинику с сайта, где генератор ПН-99 / Тс-99m была элюируют. Задержки более чем на 2 часа приведет к значительному снижению маркировки клеток. Тем не менее, достаточное изотоп включены в клетки для выполнения гамма сцинтиграфии до 36 ч (Рис.2). Факторы, которые могут улучшить эффективность маркировки подробно в обсуждении.
1 (непосредственно в поражении) или региональными перфузии с помощью цифровой вены 1 или артерии 12. Intralesional имплантации возможно, когда травма в ядре сухожилия и окружен неповрежденной ткани сухожилий, который действует в качестве сосуда для клеток. Региональный перфузии является более простой путь, чтобы управлять клетки, как они вводят в кровеносный сосуд, но метод основан на предположении, что МСК способны "домой в" сухожилия поражения. Существует ограниченное доказательства того, что МСК могут специально домой в местах сухожилий поражений, но этот метод обеспечивает полезную экспериментальный подход для разработки приложений, которые могут увеличить самонаведения способность МСК.
С внутриочагового доставки маршруту, клетки будут рассматриваться как ключевой области сигнала, который остается относительно локализованной со временем, т.е.., Есть ограниченные сpread или миграции клеток в окружающую ткань сухожилия. В отличие от этого, будет постепенное снижение сигнала со временем в месте инъекции, когда клетки находятся в ведении региональной перфузии с помощью цифровой ладонной вену (рис 2). Это является общим с внутриочагового инъекции для легочных полей будет отрицательным, но в некоторых случаях на самых ранних временных точках легких может показать изотопов сигнал, который может быть координационным, а затем становится все более обобщенные (рисунок 3). Щитовидная остается отрицательным с этим администрации маршрута. Аналогично регионарной перфузии может показать фокусное сигнал в легких, которые затем становится более диффузным, но сигнал значительно более интенсивным по сравнению с наблюдаемым с внутриочагового маршрута. Щитовидная часто также показывают, фокусное сигнал.
Начальное общее количество радиоизотопов клеток (время 0, предварительного впрыска) и считает от начального гамма сцинтиграфии в области, представляющей интерес (время 0, после яnjection) отмечены и используются для расчета процентного снижения числа в каждой временной точке. Это используется для сравнения с прогнозируемым распадом Tc-99m от начальных отсчетов (рисунок 4). Расчетная кривая будет следовать предсказанный кривой. Тем не менее, после того, прогнозируемое затухание во внимание, сохранение клеток, оставшихся в месте инъекции после введения является внутриочагового около 32% (при 12 ч) и 24% (через 24 часа) (фиг.4).
Рисунок 1. Маркировка сотовый, инъекций и гамма Сцинтиграфия (А) Передача BMMSC в микроцентрифуге до маркировки с Tc-99m-HMPAO за свинца картонных защитных (экран и держатель шприца) и радиационного монитора и микроцентрифуге. (Б) Аликвоту Tc-99m-HMPAO меченых клеток высевали в чашку с культурой ткани вили высокую мorphology, жизнеспособность и пролиферация; (С) раствор для инъекций Тс-99m-HMPAO меченых клеток под ультразвуковым контролем в месте травмы правой передней конечности SDFT; (D), Гамма сцинтиграфия передних конечностей. Гамма камера позиционируется именно с помощью гидравлического маневренный руку и любой потенциал меченых клеток в контралатеральной конечности устраняются свинцовым экраном, состоявшейся между ног. Гамма-камеры аналогично расположены на груди, чтобы контролировать поле легких или на шее, чтобы контролировать поле щитовидной железы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2. Ультразвуковая и гамма сцинтиграмм о SDFT. Типичные ultrasonographs передней лапы в регионе в середине пястной в (А и (Б) поперечное сечение. Поражение в SDFT отчетливо видно, как гипоэхогенного области (по направлению к верхней части сканирования) по сравнению с неповрежденной (нормального) целостности тканей глубокой цифровой сухожилия сгибателей (DDFT), примыкающей к и под SDFT. Площадь поражения и относительных позиций сухожилий изображены на схеме ниже. Гамма scintigraphs выполняется на 3, 6 и 12 ч после инъекции радиоактивно меченных клеток приведены для клеток вводили (С) в очаг или (г) при внутривенном региональной перфузии через цифровой ладонной вену. В случае, показанном, было поглощение радиоактивно меченных клеток в месте повреждения в SDFT (сплошные стрелки). Стойкость поглощение ладонной цифровой вены обозначается пунктирной стрелкой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3. Гамма сцинтиграмм легких и щитовидной железы. Типичные сканирует от ранних временных точках приведены как для внутриочагового инъекции и региональной перфузии меченых клеток. Обратите внимание на расстояние и диффузный сигнал в легких и щитовидной железы полей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4. Распад радиоактивности записи из регионов интереса после Intralesional инъекций. В этой лошади, на счету были измерены от гамма сцинтиграмм в SDFT над 36 ч после инъекции в поражения. Левая панель: радиоактивность в каждый момент времени была рассчитана против значение времени 0. Затемatural распада в радиоактивности 99m Tc показано для сравнения. Правая панель: по оценкам, процент клеток, оставшихся. Это рассчитывается из уровня радиоактивности из регионов, представляющих интерес. В этом случае оставшийся процент клеток через 24 часа было около 24%. Мы провели этот протокол (маркировка MSC и имплантации) на 21 лошадей. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В дополнение к костного мозга, стволовые клетки, выделенные из источников, таких как жировая ткань подходят для маркировки с этим протоколом. Кроме того, клетки из замороженного состояния может быть восстановлена и расширена в культуре к желаемым номерам для маркировки исследований 12.
Критическим фактором, который определяет эффективность маркировки BMMSC это время между элюирования Tc-99m от генератора молибдена в radiopharmacy, подготовка Tc-99m-HMPAO и использование РФП в клинике. Существует обратная зависимость между эффективностью и времени маркировки после Tc-99m элюции от генератора таким образом, что задержки за этот период может значительно снизить эффективность клеточной маркировке. Таким образом, тесная координация требуется от доставки клеток из лаборатории и доставки Tc-99m в клинику в день, что клетки будут радиоактивно и имплантации. Время транспорт к КлиниС является важным фактором. Паспорт Поставщика указать, что распад Tc-99m снижает чистоту радиохимического после 2 ч после элюирования, которые могут мешать связыванию HMPAO в Tc-99m и впоследствии сумма Тс-99m-HMPAO приняты до клетками. Мы также отметили, что маркировка культивируемых клеток в лабораторных условиях дали более эффективной маркировки, чем в клинике. Это также сообщает другом исследовании у лошадей 5, где клетки метили в лабораторных условиях. Кроме того, по нашему опыту, метка рассмотрен более эффективно клеток, которые помечены непосредственно после получения из крови или тканей по сравнению с клетками, полученными из культуры. Тем не менее, даже с низкой эффективностью маркировки имеется достаточно этикетки связавшийся с клетками для выполнения сцинтиграфии более 36 ч.
Эффективность маркировка 40% - 80% может быть достигнута за лейкоцитов, если Tc-99m используется от Асвежие генератор элюата в течение 30 мин и реакции, проводимой в небольшом объеме (1 - 0,5 мл) 18. Эффективность маркировка 47% - 71% были достигнуты за лошадей МСК 19 демонстрирует, что можно повысить эффективность маркировки МСК при идеальных условиях.
Мы регулярно имплантировать 20 миллионов клеток для лечения поражений SDFT основных хотя до 40 миллионов клеток были имплантированы для крупных поражений. Аналогичное количество клеток может быть имплантирован через регионального перфузии, хотя этот метод обычно не используется из-за более сложной процедуры. Тем не менее, это может быть полезным для поражений, которые проходят к периферии поверхности сухожилия в надежде, что достаточное количество клеток в домашнем поражении. Отслеживание клеток с помощью гамма-сцинтиграфии может предоставить полезную информацию о движении клеток, находящихся в ведении различных маршрутов. В этом протоколе, имплантированные клетки в очаг поражения маршруте mostlу сохранил в месте инъекции в очаг поражения маршрута. Радиоизотопные сигнал можно наблюдать в легочных полей в некоторых случаях, но он появляется в общем, что есть немного миграция клеток от поражения сайта. Доставка BMMSC региональной перфузии предполагает, что могут быть удерживание клеток в месте повреждения, но при доставке посредством внутривенной инъекции 4 мы не наблюдали хоминга клеток. Этикетка Тс-99m-HMPAO не влияет на клетки миграции способность 20 и, как Тс-99m-HMPAO интернализуется клетками и сохраняется в цитоплазме, вряд ли вмешиваться в адгезионных свойств.
Расчет сигнала из регионов, представляющих интерес, может быть занижена, как это возможно, что, что может быть важным диссоциации этикетке из клеток (освобождается от мертвых клеток или других механизмов освобождения от живых клеток). Щитовидная захватывает бесплатно изотоп (Тс-99m) освобождается от отмерших клеток или умирающих, и Tc-99 м HMPAO может быть устранена в почках и кишечнике. Эти ткани можно контролировать с помощью гамма сцинтиграфии, чтобы оценить потенциальную потерю этикетке.
Процедура мечения клеток может быть адаптирована для тестирования сохранение клеток и поглощение в различных местах (органы и травмы), используя различные маршруты доставки. Фокусное характер сигнала в легких может свидетельствовать о клеточных агрегатов, которые предположительно разбивают со временем или войти лизиса клеток. Щитовидная, который захватывает бесплатно изотоп, по-видимому показывает увеличение поглощения следующий региональной перфузии, так как введенные клетки и в результате мусор из мертвых клеток имеют более доступную маршрут на щитовидной железе через обращении. Хотя только около 24% клеток остаются после 24 часов, то в очаг поражения маршрут в сухожилия наиболее эффективным способом доставки, как в большинстве случаев не показали бесплатный Tc-99m в щитовидной железе. Информация, полученная от использования таких протоколов может сообщить будущего дизайна и развития стволовых клеток заявок на моRe эффективных клинических методов лечения.
Протокол мечения клеток был адаптирован для использования в лошади от Tc-99m-HMPAO маркировки лейкоцитов в медицинских применений человека. Его использование в этом протоколе показывает применимость в большом животного, в котором сухожилия болезнь возникает спонтанно для исследования клеточной терапии. Вербовка клинических случаях может помочь компенсировать более высокие затраты, связанные с работой с крупным животным. Процедура маркировки для использования в качестве изображения модальности был описан в небольших животных моделях 21 и мы считаем, что протокол может быть аналогичным образом использованы в более крупных животных, таких как овцы для исследований других заболеваний сухожилий.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Technetium99m | Please enquire with local ionisation radiation supplier in accordance with legal requirements. The isotope must be used within 2 hr of elution from the molybdenum-99 generator | ||
| Ceretec - Hexamethylpropyleneamine oxime (HMPAO) | GE HealthCare | Please enquire directly with GE HealthCare | |
| Microfuge, Minispin/Minispin Plus | Ependorf | 22620100 | |
| 18 G and 19 G Needles | Terumo Medical | NN-1838R (18 G); NN1938R (19 G) | |
| Syringes 1 ml and 2 ml | Scientific Laboratory Supplies Ltd | SYR6200 (1 ml); SYR6003 (2 ml) | |
| Microcentrifuge tubes 1.5 ml | Greiner Bio-One Ltd | 616201 | |
| PBS - Phosphate-Buffered Saline | LifeTechnologies | 14190 | |
| Sterile Gauze Swabs | Shermond Ltd | UNG602 | |
| CoflexVet self adhering bandage | Andover Healthcare, Inc. | 3540RB-018 | |
| Ultrasound imaging software | Scion Image, Scion Corporation, USA | ||
| MicasXplus Scintigram processing software | Bartec Technologies Ltd | http://www.bartectechnologies.com/veterinaryscintigraphy.html | |
| Field isotope counter for monitoring isotope | John Caunt U.K. | GMS1800a | http://www.johncaunt.com/ |
| Well counter for isotope measurements, dose calibrator | Capintec Southern Scientific | CRC-25R |
References
- Becerra, P., et al. Distribution of injected technetium(99m)-labeled mesenchymal stem cells in horses with naturally occurring tendinopathy. Journal of Orthopaedic Research. 31, 1096-1102 (2013).
- Nixon, A. J., Dahlgren, L. A., Haupt, J. L., Yeager, A. E., Ward, D. L. Effect of adipose-derived nucleated cell fractions on tendon repair in horses with collagenase-induced tendinitis. American Journal of Veterinary Research. 69, 928-937 (2008).
- Schnabel, L. V., et al. Mesenchymal stem cells and insulin-like growth factor-I gene-enhanced mesenchymal stem cells improve structural aspects of healing in equine flexor digitorum superficialis tendons. Journal of Orthopaedic Research. 27, 1392-1398 (2009).
- Smith, R. K., et al. Beneficial effects of autologous bone marrow-derived mesenchymal stem cells in naturally occurring tendinopathy. PloS one. 8, e75697 (2013).
- Sole, A., et al. Distribution and persistence of technetium-99 hexamethyl propylene amine oxime-labelled bone marrow-derived mesenchymal stem cells in experimentally induced tendon lesions after intratendinous injection and regional perfusion of the equine distal limb. Equine Veterinary Journal. 45, 726-731 (2013).
- Godwin, E. E., Young, N. J., Dudhia, J., Beamish, I. C., Smith, R. K. Implantation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells demonstrates improved outcome in horses with overstrain injury of the superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 44, 25-32 (2012).
- Crevier-Denoix, N., et al. Mechanical properties of pathological equine superficial digital flexor tendons. Equine Veterinary Journal. 29, Suppl S23. 23-26 (1997).
- O'Meara, B., Bladon, B., Parkin, T. D., Fraser, B., Lischer, C. J. An investigation of the relationship between race performance and superficial digital flexor tendonitis in the Thoroughbred racehorse. Equine Veterinary Journal. 42, 322-326 (2010).
- Alexander, R. M. Energy-saving mechanisms in walking and running. The Journal of Experimental Biology. 160, 55-69 (1991).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Monitoring the fate of autologous and allogeneic mesenchymal progenitor cells injected into the superficial digital flexor tendon of horses: preliminary study. Equine Veterinary Journal. 40, 178-181 (2008).
- Guest, D. J., Smith, M. R., Allen, W. R. Equine embryonic stem-like cells and mesenchymal stromal cells have different survival rates and migration patterns following their injection into damaged superficial digital flexor tendon. Equine Veterinary Journal. 42, 636-642 (2010).
- Sole, A., et al. Scintigraphic evaluation of intra-arterial and intravenous regional limb perfusion of allogeneic bone marrow-derived mesenchymal stem cells in the normal equine distal limb using (99m) Tc-HMPAO. Equine Veterinary Journal. 44, 594-599 (2012).
- Carvalho, A. M., et al. Evaluation of mesenchymal stem cell migration after equine tendonitis therapy. Equine Veterinary Journal. 46, 635-638 (2014).
- Welling, M. M., Duijvestein, M., Signore, A., van der Weerd, L. In vivo biodistribution of stem cells using molecular nuclear medicine imaging. Journal of Cellular Physiology. 226, 1444-1452 (2011).
- Dowling, B. A., Dart, A. J., Hodgson, D. R., Smith, R. K. Superficial digital flexor tendonitis in the horse. Equine Veterinary Journal. 32, 369-378 (2000).
- Kasashima, Y., Ueno, T., Tomita, A., Goodship, A. E., Smith, R. K. Optimisation of bone marrow aspiration from the equine sternum for the safe recovery of mesenchymal stem cells. Equine Veterinary Journal. 43, 288-294 (2011).
- Avella, C. S., et al. Ultrasonographic assessment of the superficial digital flexor tendons of National Hunt racehorses in training over two racing seasons. Equine Veterinary Journal. 41, 449-454 (2009).
- de Vries, E. F., Roca, M., Jamar, F., Israel, O., Signore, A. Guidelines for the labelling of leucocytes with (99m)Tc-HMPAO. Inflammation/Infection Taskgroup of the European Association of Nuclear Medicine. European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging. 37, 842-848 (2010).
- Trela, J. M., et al. Scintigraphic comparison of intra-arterial injection and distal intravenous regional limb perfusion for administration of mesenchymal stem cells to the equine foot. Equine Veterinary Journal. 46, 479-483 (2014).
- Barbash, I. M., et al. Systemic delivery of bone marrow-derived mesenchymal stem cells to the infarcted myocardium: feasibility, cell migration, and body distribution. Circulation. 108, 863-868 (2003).
- Heckl, S. Future contrast agents for molecular imaging in stroke. Current Medicinal Chemistry. 14, 1713-1728 (2007).
