زراعة ماوس القلب صمامات في مصغرة نظام زراعة الأنسجة
Summary
Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.
Abstract
Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure.
Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive.
In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.
Introduction
مرض صمام القلب هو سبب رئيسي للمراضة والوفيات في العالم الغربي. انتشاره يزيد مع التقدم في السن ويؤثر على أكثر من 10٪ من السكان 75 سنة فأكثر 1. صمامات الجزء النظامية للقلب، والصمام الأورطي والتاجي، ومعظمهم من المتضررين. يتميز مرض صمام القلب من جراء فقدان هيكل درجة عالية من التنظيم للصمامات، الذي ينتج تغيير في الخواص الميكانيكية 2. السلامة الهيكلية ذلك فمن الأهمية البالغة وظيفة الصمام.
وتتألف منشورات صمام الخلايا صمامي الخلالي (VIC)، الخلايا البطانية صمامي (VEC)، والمصفوفة خارج الخلية، الذي يتم تنظيمه للغاية في نمط الطبقات 3،4. وفيكس هي المسؤولة عن تركيب ECM، وتدهور والتنظيم. العوامل النابعة من مجرى الدم، ECS أو المقيمين في فعل ECM على فيكس بتدبير وظيفتها. بالإضافة،تعمل القوى الميكانيكية على النشرة خلال دورة القلب مما أدى إلى الصفحي أو إجهاد القص متذبذبة، يؤكد الضغط أو الشد التأثير على سلوك فيكس 5.
من أجل فهم كيفية تنظيم هيكل صمام، يجب أولا أن يفهم كيف فيكس لرد على مجموعة متنوعة من المحفزات شهدت خلال دورة القلب. وقد تم في الدراسات المختبرية مفيدة للغاية حول خصائص وقدرات الخلايا صمامي. استجابة هذه الخلايا في المختبر، ومع ذلك، قد لا تحاكي بدقة دائما الاستجابة في الجسم الحي 6؛ على سبيل المثال، استجابة للمؤثرات VIC تعتمد على وجود ECS وتكوين ECM 5. وعلاوة على ذلك، واستجابة خلايا صمامي للمنبهات تعتمد على مواقعها المحددة في النشرة 7. بالإضافة إلى المحفزات الحيوية، يتم تحديد سلوك الخلايا صمامي من قبل القوات الميكانيكية س يتصرفن صمام 8. يخضع كل منطقة من صمام لتشكيلتها الخاصة من الضغوط الدورة الدموية. على الرغم من أن النماذج الحالية فيفو السابقين قد أظهرت أن القوى الميكانيكية هي محددات هامة للبنية صمامي 5، والآليات المرتبطة بها لا تزال غير واضحة. في حين قدمت النماذج في الجسم الحي نظرة ثاقبة الآليات الجزيئية الكامنة وراء تطوير صمامي 9،10، نظرة ثاقبة صمامي البيولوجيا الكبار لا تزال بعيدة المنال.
لذلك، تم وضع فيفو السابقين نموذج تدفق فيه صمامات القلب يمكن تربيتها في وضع طبيعي في القلب لفترة طويلة من الزمن 11. هذا له ميزة أنه لا تزال الصمامات في شكلها الطبيعي وفيكس تجربة نفس البيئة كما هو الحال في الجسم الحي، مما يجعل ردود فيكس للمحفزات طبيعية قدر الإمكان. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ثقافة الصمامات في وضعهم الطبيعي في قلب يسهل إخضاع كلالمنطقة صمامي لضغوط الدورة الدموية ذات الصلة. في هذا النموذج المجراة سابقا، أي نظام زراعة الأنسجة مصغرة (تلك الخلايا)، والصمامات يمكن أن تتعرض لمختلف المحفزات الحيوية والدورة الدموية مما يتيح للتحقيق لدورهم في القلب إعادة عرض الصمام.
Protocol
Representative Results
Discussion
وتشمل الخطوات الحاسمة في زراعة الصمامات الماوس القلب مما يجعل الوقت بين استئصال القلب من الماوس وربط في غرفة نضح قصيرة قدر الإمكان لضمان سلامة وربط الإبر عمودي على الصمامات لضمان الاتجاه الصحيح من تدفق . بالإضافة إلى ذلك، والتحقق من تدفق بعد ربط في غرفة نضح دون المتو…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study is supported by the Dutch Heart Foundation and the Netherlands Institute for Regenerative Medicine.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | life technolgies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | life technolgies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | life technolgies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | life technolgies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0,8 x1,59 x 0,40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics–2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2013).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and Cellular Response Feedback in Calcific Aortic Valve Disease. Circulation Research. 113 (2), 186-197 (2013).
- Kruithof, B. P. T., Krawitz, S. A., Gaussin, V. Atrioventricular valve development during late embryonic and postnatal stages involves condensation and extracellular matrix remodeling. Developmental biology. 302 (1), 208-217 (2007).
- Schoen, F. J. Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement. Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 14 (4), 189-194 (2005).
- Balachandran, K., Sucosky, P., Yoganathan, A. P. Hemodynamics and mechanobiology of aortic valve inflammation and calcification. International journal of inflammation. , 263870 (2011).
- Butcher, J. T., Simmons, C. A., Warnock, J. N. Mechanobiology of the Aortic Heart Valve. The Journal of heart valve disease. 17 (1), 62-73 (2008).
- Balachandran, K., Konduri, S., Sucosky, P., Jo, H., Yoganathan, A. P. An ex vivo study of the biological properties of porcine aortic valves in response to circumferential cyclic stretch. Annals of biomedical engineering. 34 (11), 1655-1665 (2006).
- Weiler, M., Hwai Yap, C., Balachandran, K., Padala, M., Yoganathan, A. P. Regional analysis of dynamic deformation characteristics of native aortic valve leaflets. Journal of Biomechanics. 44, 1459-1465 (2011).
- Combs, M. D., Yutzey, K. E. Heart valve development: Regulatory networks in development and disease. Circulation Research. 105, 408-421 (2009).
- Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -. J. TGFβ and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken. Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).
- Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves. Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).
