Kweken Muis hartkleppen in de Miniature Tissue Culture System
Summary
Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.
Abstract
Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure.
Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive.
In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.
Introduction
Hartklepaandoeningen is een belangrijke oorzaak van morbiditeit en sterfte in de Westerse wereld; de prevalentie stijgt met de leeftijd en bij meer dan 10% van de bevolking 75 jaar en ouder 1. De kleppen van de systemische deel van het hart, de aorta en mitralis kleppen, meestal beïnvloed. Hartklepaandoeningen wordt gekenmerkt door het verlies van de goed georganiseerde structuur van de kleppen, waardoor de verandering van de mechanische eigenschappen 2. De structurele integriteit is dus cruciaal voor het functioneren van de klep.
De bladen van de klep bestaan uit valvulaire interstitiële cellen (VIC), valvulaire endotheelcellen (VEC) en extracellulaire matrix, die sterk georganiseerd een gelaagd patroon 3,4. De VIC zijn verantwoordelijk voor de synthese van ECM afbraak en organisatie. Factoren die voortvloeien uit de bloedbaan, EC of die in de ECM-act op het VIC orkestreren van zijn functie. Daarnaast,mechanische krachten op de folder tijdens de cardiale cyclus resulteert in een laminaire of oscillerende shear stress, druk- of trekspanningen het gedrag van VIC 5 beïnvloeden.
Om te begrijpen hoe de structuur van de klep wordt geregeld, moet eerst worden begrepen hoe VIC's reageren op de gevarieerde set van stimuli ervaren tijdens de cardiale cyclus. In vitro studies hebben zeer informatief over de kenmerken en mogelijkheden van de valvulaire cellen geweest. De respons van deze cellen in vitro, kan echter niet altijd goed mogelijk de in vivo reactie 6 bootsen; bijvoorbeeld de reactie van VIC op stimuli is afhankelijk van de aanwezigheid van EC en de ECM samenstelling 5. Bovendien is de respons van de valvulaire cellen op prikkels is afhankelijk van de specifieke locatie in de bijsluiter 7. Naast biochemische stimuli, is het gedrag van de valvulaire cellen bepaald door mechanische krachten on de klep 8. Elke regio van de klep wordt blootgesteld aan zijn eigen specifieke set van hemodynamische stress. Hoewel huidige ex vivo modellen hebben aangetoond dat mechanische krachten zijn belangrijke determinanten van valvulaire structuur 5, de bijbehorende mechanismen zijn nog onduidelijk. Terwijl in vivo modellen inzicht hebben gegeven in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan valvular ontwikkeling 9,10, inzichten in volwassen valvulaire biologie is nog steeds ongrijpbaar.
Daarom werd een ex vivo stromingsmodel ontwikkeld waarbij de hartkleppen kunnen worden gekweekt in hun natuurlijke positie in het hart langere tijd 11. Dit heeft het voordeel dat de kleppen blijven in hun natuurlijke configuratie en de VIC ervaren dezelfde omgeving als in vivo, waardoor de VIC respons zo natuurlijk mogelijk stimuli. Daarnaast is de cultuur van de kleppen in hun natuurlijke positie in het hart vergemakkelijkt het onderwerpen van elkvalvulaire regio om de relevante hemodynamische spanningen. In dit ex vivo model, dat wil zeggen, de miniatuur Tissue Culture System (MTCS), de kleppen kunnen worden onderworpen aan verschillende biochemische en hemodynamische stimuli waardoor het onderzoek naar hun rol in hartklep remodeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritische stappen in kweken van cardiale muis kleppen omvatten het maken van de tijd tussen excisie van het hart van de muis en de ligatie in de perfusie kamer zo kort mogelijk de levensvatbaarheid en ligatie van de naalden waarborgen loodrecht op de kleppen juiste richting van de doorstroming . Bovendien, het controleren van de flow na ligatie in de perfusie kamer zonder medium zorgt voor een goede inbrengen en ligatie van naalden. Het is cruciaal om een steriele cultuur en het voorkomen van luchtbellen in de sla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study is supported by the Dutch Heart Foundation and the Netherlands Institute for Regenerative Medicine.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | life technolgies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | life technolgies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | life technolgies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | life technolgies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0,8 x1,59 x 0,40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics–2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2013).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and Cellular Response Feedback in Calcific Aortic Valve Disease. Circulation Research. 113 (2), 186-197 (2013).
- Kruithof, B. P. T., Krawitz, S. A., Gaussin, V. Atrioventricular valve development during late embryonic and postnatal stages involves condensation and extracellular matrix remodeling. Developmental biology. 302 (1), 208-217 (2007).
- Schoen, F. J. Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement. Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 14 (4), 189-194 (2005).
- Balachandran, K., Sucosky, P., Yoganathan, A. P. Hemodynamics and mechanobiology of aortic valve inflammation and calcification. International journal of inflammation. , 263870 (2011).
- Butcher, J. T., Simmons, C. A., Warnock, J. N. Mechanobiology of the Aortic Heart Valve. The Journal of heart valve disease. 17 (1), 62-73 (2008).
- Balachandran, K., Konduri, S., Sucosky, P., Jo, H., Yoganathan, A. P. An ex vivo study of the biological properties of porcine aortic valves in response to circumferential cyclic stretch. Annals of biomedical engineering. 34 (11), 1655-1665 (2006).
- Weiler, M., Hwai Yap, C., Balachandran, K., Padala, M., Yoganathan, A. P. Regional analysis of dynamic deformation characteristics of native aortic valve leaflets. Journal of Biomechanics. 44, 1459-1465 (2011).
- Combs, M. D., Yutzey, K. E. Heart valve development: Regulatory networks in development and disease. Circulation Research. 105, 408-421 (2009).
- Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -. J. TGFβ and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken. Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).
- Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves. Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).
