Cultura Rato Cardiac Valves no Sistema de Cultura de Tecidos Miniature
Summary
Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.
Abstract
Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure.
Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive.
In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.
Introduction
Doença valvar cardíaca é uma das principais causas de morbidade e mortalidade no mundo ocidental; sua prevalência aumenta com a idade e afeta mais de 10% da população de 75 anos ou mais 1. As válvulas da parte sistêmica do coração, as valvas aórtica e mitral, são os mais afetados. Válvula cardíaca doença é caracterizada pela perda da estrutura altamente organizada das válvulas, o que resulta na alteração das propriedades mecânicas 2. A integridade estrutural é, portanto, crucial para a função da válvula.
Os folhetos da válvula são constituídos por células intersticiais valvulares (VIC), células endoteliais valvulares (VEC), e matriz extracelular, o que é altamente organizado num padrão em camadas 3,4. Os VICs são responsáveis pela síntese de ECM, degradação e organização. Fatores que emana da corrente sanguínea, ECs ou residentes no ato ECM nas VICs orquestrando sua função. Além,forças mecânicas agir sobre o folheto durante o ciclo cardíaco, resultando em laminar ou tensão de cisalhamento oscilatório, tensões de compressão ou de tracção que influenciam o comportamento de VICs 5.
A fim de compreender como a estrutura da válvula é regulado, ele deve primeiro ser compreendida como VICs responder ao conjunto diversificado de estímulos experimentadas durante o ciclo cardíaco. Estudos in vitro têm sido muito informativo sobre as características e capacidades das células valvulares. A resposta destas células, in vitro, no entanto, nem sempre podem mimetizar com exactidão a resposta in vivo 6; Por exemplo, a resposta a estímulos de VIC é dependente da presença de células endoteliais e a composição 5 ECM. Além disso, a resposta das células a estímulos valvulares depende da sua localização específica no folheto 7. Além disso a estímulos bioquímicos, o comportamento das células valvulares é determinada por forças mecânicas que actuam ón a válvula 8. Cada região da válvula é submetida a seu próprio conjunto específico de tensões hemodinâmicas. Embora atuais modelos ex vivo têm mostrado que as forças mecânicas são importantes determinantes da estrutura valvular 5, os mecanismos associados ainda não estão claros. Enquanto os modelos in vivo têm fornecido insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento valvular 9,10, insights sobre biologia valvular adulto ainda é indescritível.
Por conseguinte, um modelo ex vivo de fluxo foi desenvolvido em que as válvulas cardíacas podem ser cultivadas na sua posição natural no coração por um período prolongado de tempo 11. Isto tem a vantagem de que as válvulas permanecem na sua configuração natural e os VICs experimentar o mesmo ambiente como in vivo, fazendo com que as respostas a estímulos VICs tão natural quanto possível. Além disso, a cultura das válvulas na sua posição natural no coração facilita a sujeição de cada umregião valvular às tensões hemodinâmicas relevantes. Neste modelo ex vivo, isto é, o sistema de cultura de tecidos em miniatura (MTCS), as válvulas podem ser submetidos a diferentes estímulos bioquímicos e hemodinâmicas, permitindo o estudo do seu papel na remodelação da válvula cardíaca.
Protocol
Representative Results
Discussion
As etapas críticas em cultura das válvulas cardíacas de rato incluem fazer o tempo entre a excisão do coração do rato e a ligação na câmara de perfusão tão curto quanto possível, para assegurar a viabilidade e ligação das agulhas perpendicular às válvulas para assegurar a direcção correcta de fluxo . Além disso, a verificação do fluxo após a ligadura na câmara de perfusão sem forma garante uma inserção correcta e ligadura de agulhas. É essencial para manter uma cultura estéril e evitar bolhas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study is supported by the Dutch Heart Foundation and the Netherlands Institute for Regenerative Medicine.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | life technolgies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | life technolgies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | life technolgies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | life technolgies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0,8 x1,59 x 0,40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics–2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2013).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and Cellular Response Feedback in Calcific Aortic Valve Disease. Circulation Research. 113 (2), 186-197 (2013).
- Kruithof, B. P. T., Krawitz, S. A., Gaussin, V. Atrioventricular valve development during late embryonic and postnatal stages involves condensation and extracellular matrix remodeling. Developmental biology. 302 (1), 208-217 (2007).
- Schoen, F. J. Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement. Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 14 (4), 189-194 (2005).
- Balachandran, K., Sucosky, P., Yoganathan, A. P. Hemodynamics and mechanobiology of aortic valve inflammation and calcification. International journal of inflammation. , 263870 (2011).
- Butcher, J. T., Simmons, C. A., Warnock, J. N. Mechanobiology of the Aortic Heart Valve. The Journal of heart valve disease. 17 (1), 62-73 (2008).
- Balachandran, K., Konduri, S., Sucosky, P., Jo, H., Yoganathan, A. P. An ex vivo study of the biological properties of porcine aortic valves in response to circumferential cyclic stretch. Annals of biomedical engineering. 34 (11), 1655-1665 (2006).
- Weiler, M., Hwai Yap, C., Balachandran, K., Padala, M., Yoganathan, A. P. Regional analysis of dynamic deformation characteristics of native aortic valve leaflets. Journal of Biomechanics. 44, 1459-1465 (2011).
- Combs, M. D., Yutzey, K. E. Heart valve development: Regulatory networks in development and disease. Circulation Research. 105, 408-421 (2009).
- Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -. J. TGFβ and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken. Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).
- Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves. Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).
