Dyrkning Mus hjerteklapper i Miniature Tissue Culture System
Summary
Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.
Abstract
Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure.
Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive.
In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.
Introduction
Hjerteklap sygdom er en væsentlig årsag til sygelighed og dødelighed i den vestlige verden; dens udbredelse stiger med alderen, og det påvirker mere end 10% af befolkningen 75 år og derover 1. Ventilerne af den systemiske del af hjertet, aorta og mitralklapper, er for det meste påvirket. Hjerteklap sygdom er karakteriseret ved tabet af den meget organiseret struktur af ventilerne, hvilket resulterer i ændring af de mekaniske egenskaber 2. Den strukturelle integritet er derfor afgørende for funktionen af ventilen.
De foldere af ventilen består af skallerne interstitielle celler (VIC), valvulær endotelceller (VEC) og ekstracellulær matrix, som er meget organiseret i en lagdelt mønster 3,4. De VIC'erne er ansvarlige for ECM syntese, nedbrydning og organisation. Faktorer der udgår fra blodbanen, EC'er eller bopæl i ECM handle på VIC'erne orkestrere sin funktion. Desuden,mekaniske kræfter virker på indlægssedlen i hjertecyklussen resulterer i laminar eller oscillerende forskydningsspænding, sammentrykkende eller trækspændinger påvirker adfærd VIC'erne 5.
For at forstå, hvordan strukturen af ventilen reguleres, skal det først forstået VIC'erne reagere på forskellige sæt af stimuli oplevet under hjertecyklussen. In vitro-undersøgelser har været meget informativ om karakteristika og evner valvulær celler. Svaret af disse celler in vitro, kan dog ikke altid nøjagtigt efterligne in vivo responset 6; for eksempel reaktion på stimuli VIC er afhængig af tilstedeværelsen af EC'er og ECM præparat 5. Desuden svaret af valvulær celler til stimuli, afhænger af deres specifikke placering i pjecen 7. Ud over biokemiske stimuli, er opførslen af valvulær celler bestemmes ved hjælp af mekaniske kræfter, der virker on ventilen 8. Hver region af ventilen udsættes for sin egen specifikke sæt af hæmodynamiske spændinger. Selvom de nuværende ex vivo-modeller har vist, at mekaniske kræfter er vigtige determinanter for valvulær struktur 5, de associerede mekanismer er stadig uklart. Mens in vivo-modeller har givet indsigt i de molekylære mekanismer bag valvulær udvikling 9,10, indsigt i voksen valvulær biologi er stadig undvigende.
Derfor er en ex vivo flow model blev udviklet, hvor hjerteklapper kan dyrkes i deres naturlige stilling i hjertet i en længere periode 11. Dette har den fordel, at ventilerne forbliver i deres naturlige konfiguration og VIC'erne opleve det samme miljø som in vivo, hvilket gør VIC svar på stimuli så naturligt som muligt. Hertil kommer, at kulturen af ventilerne i deres naturlige stilling i hjertet letter underkaste hvervalvulær regionen til de relevante hæmodynamiske spændinger. I denne ex vivo-model, dvs. Miniature Tissue Culture System (MTCS), kan ventilerne udsættes for forskellige biokemiske og hæmodynamiske stimuli til efterforskning af deres rolle i hjerteklap remodeling.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trin i dyrkning af kardiale mus ventiler indbefatter gør tiden mellem udskæring af hjertet fra musen og ligering i perfusionskammeret så kort som muligt for at sikre levedygtighed og ligering af nåle vinkelret ventilerne for at sikre korrekt retning af strømmen . Derudover tjekker flowet efter ligering i perfusionskammeret uden medium sikrer korrekt isætning og ligering af nåle. Det er afgørende at opretholde en steril kultur og forhindre luftbobler i slangen, som potentielt kunne blive fanget i hjertet…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study is supported by the Dutch Heart Foundation and the Netherlands Institute for Regenerative Medicine.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | life technolgies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | life technolgies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | life technolgies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | life technolgies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0,8 x1,59 x 0,40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics–2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2013).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and Cellular Response Feedback in Calcific Aortic Valve Disease. Circulation Research. 113 (2), 186-197 (2013).
- Kruithof, B. P. T., Krawitz, S. A., Gaussin, V. Atrioventricular valve development during late embryonic and postnatal stages involves condensation and extracellular matrix remodeling. Developmental biology. 302 (1), 208-217 (2007).
- Schoen, F. J. Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement. Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 14 (4), 189-194 (2005).
- Balachandran, K., Sucosky, P., Yoganathan, A. P. Hemodynamics and mechanobiology of aortic valve inflammation and calcification. International journal of inflammation. , 263870 (2011).
- Butcher, J. T., Simmons, C. A., Warnock, J. N. Mechanobiology of the Aortic Heart Valve. The Journal of heart valve disease. 17 (1), 62-73 (2008).
- Balachandran, K., Konduri, S., Sucosky, P., Jo, H., Yoganathan, A. P. An ex vivo study of the biological properties of porcine aortic valves in response to circumferential cyclic stretch. Annals of biomedical engineering. 34 (11), 1655-1665 (2006).
- Weiler, M., Hwai Yap, C., Balachandran, K., Padala, M., Yoganathan, A. P. Regional analysis of dynamic deformation characteristics of native aortic valve leaflets. Journal of Biomechanics. 44, 1459-1465 (2011).
- Combs, M. D., Yutzey, K. E. Heart valve development: Regulatory networks in development and disease. Circulation Research. 105, 408-421 (2009).
- Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -. J. TGFβ and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken. Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).
- Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves. Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).
