Dyrking Mouse Cardiac Ventiler i miniatyr Tissue Culture System

Summary

Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.

Abstract

Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure.

Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive.

In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.

Introduction

Hjertet ventil sykdom er en viktig årsak til sykelighet og dødelighet i den vestlige verden; prevalensen øker med alderen, og det påvirker mer enn 10% av befolkningen 75 år og eldre ^en. Ventilene av den systemiske del av hjertet, aorta og mitral ventiler, er mest påvirket. Hjerteklaffen sykdom er karakterisert ved tapet av svært organisert struktur av ventilene, noe som resulterer i forandring av de mekaniske egenskaper ^2. Den strukturelle integritet er derfor avgjørende for funksjonen av ventilen.

Flygeblader av ventilen består av klaffe interstitielle celler (VIC), klaffe endotelceller (VEC) og ekstracellulære matrise, som er svært organisert i en lagdelt mønster ^3,4. De Vics er ansvarlig for ECM syntese, nedbrytning og organisasjon. Faktorer som kommer fra blodet, egenkapitalbevis eller bosatt i ECM handle på Vics iscenesetter sin funksjon. I tillegg,mekaniske krefter virker på pakningsvedlegget under hjertesyklusen som resulterer i laminær eller oscillerende skjærspenning, kompresjons eller strekkspenninger som påvirker atferden til Vics ^5.

For å forstå hvordan strukturen av ventilen er regulert, må det først bli forstått hvordan Vics svare på det varierte sett av stimuli opplevde under hjertesyklusen. In vitro studier har vært veldig lærerikt om egenskaper og evner av valvulære celler. Responsen av disse cellene in vitro, men kan ikke alltid nøyaktig etterligne in vivo respons ^6; for eksempel, er responsen av VIC på stimuli avhengig av tilstedeværelse av ECS og ECM sammensetning ^5. Videre er responsen fra klaffe celler til stimuli, avhenger av deres spesifikke plasser i heftet ^7. I tillegg til biokjemiske stimuli, er oppførselen til klaffe cellene bestemmes ved hjelp av mekaniske krefter som virker on ventilen ^8. Hver region av ventilen blir utsatt for sin egen spesielle sett av hemodynamiske påkjenninger. Selv om dagens ex vivo modeller har vist at mekaniske krefter er viktige faktorer som bestemmer klaffe struktur ^5, tilhørende mekanismene er fortsatt uklart. Mens in vivo-modeller har gitt innsikt i de molekylære mekanismene bak klaffe utvikling ^9,10, innsikt i voksen klaffe biologi er fortsatt unnvikende.

Derfor ble en ex vivo strømningsmodell utviklet hvor hjerteklaffer kan dyrkes i sin naturlige stilling i hjertet i en lengre tidsperiode ^11. Dette har den fordel at ventilene forblir i deres naturlige konfigurasjon og VICS oppleve det samme miljø som in vivo, noe som gjør VICS respons på stimuli så naturlig som mulig. I tillegg, kulturen av ventilene i sin naturlige stilling i hjertet letter å underkaste hvertklaffe region til relevante hemodynamiske påkjenninger. I denne ex vivo-modell, dvs. Miniature Tissue Culture System (MTCS), ventilene kan bli utsatt for forskjellige biokjemiske og hemodynamiske stimuli som tillater undersøkelse av deres rolle i hjerteventil remodeling.

Protocol

Denne protokollen følger LUMC retningslinjene for dyret forskningsetisk komité. 1. Utarbeidelse av Instruments, dyrkingsmedium, og MTCS Merk: Utfør alle forberedelser i laminær hette. Den MTCS perfusjon kammer, boble felle og stativ er beskrevet i Lieber et al., 2010 11. Desinfisere tang og mikro saks med 70% etanol. Forberede en 5 ml sprøyte med 21G nål med steril Tyrodes Buffer (130 mM NaCl, 5,4 mM KCl, 6,0 mM Hepes, 1,2 mM …

Representative Results

Aortaklaff (figur 2) eller mitral ventil 11 kan være dyrket i minst 3 dager. Ved dyrking i åpen stilling (som representerer det systoliske posisjon for aortaventilen og det diastoliske posisjon for mitral ventil), ventil cellene forblir levedyktig. Ingen celledød observeres som bestemt ved fravær av TUNEL-positive celler (figur 2H, I) eller spaltet caspase-3-ekspresjon (som ikke er vist og Lieber et al., 2010 11). Kollagen fordeling (som visualisert ve…

Discussion

Kritiske trinn i dyrking av hjertemuse ventilene inkluderer å tiden mellom eksisjon av hjertet fra musen og ligering i perfusjon kammeret så kort som mulig for å sikre levedyktigheten og ligering av nålene perpendikulært på ventiler for å sikre riktig retning av strømnings . I tillegg sjekker strømmen etter ligation i perfusjon kammeret uten medium sikrer riktig innsetting og ligering av nåler. Det er viktig å opprettholde et sterilt kultur og hindre luftbobler i slangen, som potensielt kan bli fanget i hjert…

Materials

Dulbecco’s Modified Eagle Medium	life technolgies	10569-010
Fetal Bovine Serum	life technolgies	26140
Insulin-Transferrin-Selenium	life technolgies	41400-045
Antibiotic-Antimycotic	life technolgies	15240-06
Silk 7-0	Ethicon	768G
100 mm culture dish	Greiner bio-one	664160
50 ml tube	Greiner bio-one	227261
5 ml syringe	BD	309649
21 G needle	BD	304432
Heparin	LEO	012866-08
Forceps	Fine Science Tools	11295-00
Micro Scissors, Economy, Vannas-type	Tedpella	1346
Silicon tubing	Thermo Scientific	8060-0020	I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm
Silicon tubing for pump	Masterflex	96400-13	I.D. x O.D. x Wall: 0,8 x1,59 x 0,40 mm
Biocompatible glue (Histoacryl)	B. Braun	1050071
precision vaporizer	Dräger	Vapor 200
peristaltic roller pump	Masterflex	7521-35
Easy-load pump head	Masterflex	7518-00
Flow chamber			see Lieber et al., 2010
Bubble trap			see Lieber et al., 2010