Odling Mouse hjärtklaffar i miniatyr Tissue Culture System
Summary
Here, we present an ex vivo flow model in which murine cardiac valves can be cultured allowing the study of the biology of the valve.
Abstract
Heart valve disease is a major burden in the Western world and no effective treatment is available. This is mainly due to a lack of knowledge of the molecular, cellular and mechanical mechanisms underlying the maintenance and/or loss of the valvular structure.
Current models used to study valvular biology include in vitro cultures of valvular endothelial and interstitial cells. Although, in vitro culturing models provide both cellular and molecular mechanisms, the mechanisms involved in the 3D-organization of the valve remain unclear. While in vivo models have provided insight into the molecular mechanisms underlying valvular development, insight into adult valvular biology is still elusive.
In order to be able to study the regulation of the valvular 3D-organization on tissue, cellular and molecular levels, we have developed the Miniature Tissue Culture System. In this ex vivo flow model the mitral or the aortic valve is cultured in its natural position in the heart. The natural configuration and composition of the leaflet are maintained allowing the most natural response of the valvular cells to stimuli. The valves remain viable and are responsive to changing environmental conditions. This MTCS may provide advantages on studying questions including but not limited to, how does the 3D organization affect valvular biology, what factors affect 3D organization of the valve, and which network of signaling pathways regulates the 3D organization of the valve.
Introduction
Hjärtklaffsjukdom är en viktig orsak till sjuklighet och dödlighet i västvärlden; dess utbredning ökar med åldern och det påverkar mer än 10% av befolkningen 75 år och äldre 1. Ventilerna i systemdelen av hjärtat, aorta och mitralis ventiler, är oftast drabbade. Hjärtklaff sjukdom kännetecknas av förlust av den mycket organiserad struktur av ventilerna, vilket resulterar i förändring av de mekaniska egenskaperna 2. Den strukturella integriteten är därför avgörande för funktionen av ventilen.
Broschyrer av ventilen består av valvulär interstitiella celler (VIC), valvulär endotelceller (VEC) och extracellulära matrix, som är mycket organiserad i en skiktad mönster 3,4. VICS ansvarar för ECM syntes, nedbrytning och organisation. Faktorer som härrör från blodet, EC eller bosatta i ECM agera på VICS iscensätta sin funktion. Dessutommekaniska krafter verkar på bipacksedeln under hjärtcykeln vilket resulterar i laminärt eller oscillerande skjuvspänning, tryck eller dragspänningar påverkar beteendet hos Vics 5.
För att förstå hur strukturen av ventilen regleras, måste det först förstått hur Vics svara på mångfald av stimuli upplevt under hjärtcykeln. In vitro-studier har varit mycket informativ om de egenskaper och förmågor klaffcellerna. Svaret hos dessa celler in vitro kan emellertid inte alltid exakt efterlikna svar in vivo 6; till exempel, är svaret från VIC på stimuli beroende av närvaron av EC och ECM sammansättning 5. Dessutom svaret från klaffcellerna för stimuli beror på deras specifika plats i broschyren 7. Förutom biokemiska stimuli, är beteendet hos klaff cellerna bestämdes genom mekaniska krafter som verkar on ventilen 8. Varje region av ventilen utsätts för en egen uppsättning av hemodynamiska påkänningar. Även om nuvarande ex vivo-modeller har visat att mekaniska krafter är viktiga faktorer för klaffstruktur 5, tillhörande mekanismer är fortfarande oklart. Medan in vivo-modeller har gett insikt i de molekylära mekanismerna bakom klaff utveckling 9,10, är fortfarande svårfångade insikter vuxna klaff biologi.
Därför gjordes en ex vivo flödesmodell utvecklad i vilken hjärtklaffar kan odlas i sin naturliga ställning i hjärtat under en utsträckt tidsperiod 11. Detta har den fördelen att ventilerna förblir i sin naturliga konfiguration och VICS upplever samma miljö som in vivo, vilket gör VICS svar på stimuli så naturligt som möjligt. Dessutom kulturen av ventilerna i deras naturliga läge i hjärtat underlättar utsätta varjeklaff region till relevanta hemodynamiska påfrestningar. I denna ex vivo-modell, det vill säga, Miniature Tissue Culture System (MTCS), ventilerna kan utsättas för olika biokemiska och hemodynamiska stimuli som möjliggör undersökning av deras roll i hjärtklaff ombyggnad.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiska steg i odling av hjärtklaffar mus hör att göra tiden mellan utskärning av hjärtat från musen och ligeringen i perfusionskammaren så kort som möjligt för att säkerställa livsduglighet och ligering av nålarna vinkelrätt till ventilerna för att säkerställa korrekt flödesriktningen . Dessutom, kontrollera flödet efter ligering i perfusionskammaren utan mediet garanterar korrekt insättning och ligering av nålar. Det är kritiskt att upprätthålla en steril kultur och förhindra luftbubblor i sla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study is supported by the Dutch Heart Foundation and the Netherlands Institute for Regenerative Medicine.
Materials
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | life technolgies | 10569-010 | |
| Fetal Bovine Serum | life technolgies | 26140 | |
| Insulin-Transferrin-Selenium | life technolgies | 41400-045 | |
| Antibiotic-Antimycotic | life technolgies | 15240-06 | |
| Silk 7-0 | Ethicon | 768G | |
| 100 mm culture dish | Greiner bio-one | 664160 | |
| 50 ml tube | Greiner bio-one | 227261 | |
| 5 ml syringe | BD | 309649 | |
| 21 G needle | BD | 304432 | |
| Heparin | LEO | 012866-08 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-00 | |
| Micro Scissors, Economy, Vannas-type | Tedpella | 1346 | |
| Silicon tubing | Thermo Scientific | 8060-0020 | I.D. x O.D. x Wall: 1.59 x 3.18 x 0.79 mm |
| Silicon tubing for pump | Masterflex | 96400-13 | I.D. x O.D. x Wall: 0,8 x1,59 x 0,40 mm |
| Biocompatible glue (Histoacryl) | B. Braun | 1050071 | |
| precision vaporizer | Dräger | Vapor 200 | |
| peristaltic roller pump | Masterflex | 7521-35 | |
| Easy-load pump head | Masterflex | 7518-00 | |
| Flow chamber | see Lieber et al., 2010 | ||
| Bubble trap | see Lieber et al., 2010 |
References
- Go, A. S., et al. Heart Disease and Stroke Statistics–2014 Update: A Report From the American Heart Association. Circulation. 129, e28-e292 (2013).
- Gould, S. T., Srigunapalan, S., Simmons, C. A., Anseth, K. S. Hemodynamic and Cellular Response Feedback in Calcific Aortic Valve Disease. Circulation Research. 113 (2), 186-197 (2013).
- Kruithof, B. P. T., Krawitz, S. A., Gaussin, V. Atrioventricular valve development during late embryonic and postnatal stages involves condensation and extracellular matrix remodeling. Developmental biology. 302 (1), 208-217 (2007).
- Schoen, F. J. Cardiac valves and valvular pathology: update on function, disease, repair, and replacement. Cardiovascular pathology: the official journal of the Society for Cardiovascular Pathology. 14 (4), 189-194 (2005).
- Balachandran, K., Sucosky, P., Yoganathan, A. P. Hemodynamics and mechanobiology of aortic valve inflammation and calcification. International journal of inflammation. , 263870 (2011).
- Butcher, J. T., Simmons, C. A., Warnock, J. N. Mechanobiology of the Aortic Heart Valve. The Journal of heart valve disease. 17 (1), 62-73 (2008).
- Balachandran, K., Konduri, S., Sucosky, P., Jo, H., Yoganathan, A. P. An ex vivo study of the biological properties of porcine aortic valves in response to circumferential cyclic stretch. Annals of biomedical engineering. 34 (11), 1655-1665 (2006).
- Weiler, M., Hwai Yap, C., Balachandran, K., Padala, M., Yoganathan, A. P. Regional analysis of dynamic deformation characteristics of native aortic valve leaflets. Journal of Biomechanics. 44, 1459-1465 (2011).
- Combs, M. D., Yutzey, K. E. Heart valve development: Regulatory networks in development and disease. Circulation Research. 105, 408-421 (2009).
- Kruithof, B. P. T., Duim, S. N., Moerkamp, A. T., Goumans, M. -. J. TGFβ and BMP signaling in cardiac cushion formation: lessons from mice and chicken. Differentiation; research in biological diversity. 84 (1), 89-102 (2012).
- Lieber, S. C., Kruithof, B. P. T., Aubry, N., Vatner, S. F., Gaussin, V. Design of a miniature tissue culture system to culture mouse heart valves. Annals of biomedical engineering. 38 (3), 674-682 (2010).
