彗星试验测定DNA断裂,诱发不同的因素。如果所有的因素(除氧化应激)引起DNA损伤被保持恒定,DNA损伤的量是氧化应激的良好间接参数。这个协议的目标是使用彗星测定氧化应激的间接测量。
高等真核生物的生活不能没有氧气;然而,矛盾的是,氧气可以对他们有害的。氧分子在化学上是相对惰性的,因为它具有位于不同圆周率*反键轨道2未成对电子。这两个电子具有平行自旋,这意味着它们在围绕自身的轴相同的方向旋转。这就是为什么氧分子不是非常活泼。氧的活化可以由两个不同的机制发生;无论是通过经由一个电子还原的时间(一价降低),或通过足够的能量吸收扭转不成对电子的一个的旋转。这导致产生活性氧物质(ROS)的。有多种方法,其中人体消除活性氧在其生理状态。如果ROS产生超过修复能力,氧化应激的结果和损害不同的分子。有许多不同的方法,通过该氧化应激可以是我asured。这个手稿的重点是名为细胞凝胶电泳,也被称为“彗星试验”,它允许DNA断裂测定的方法之一。如果已知会导致DNA损伤,比氧化应激其它所有因素保持不变,DNA损伤的彗星试验测定的量是氧化应激的良好参数。原理是简单的,并依赖于一个事实,即DNA分子是带负电荷。一个完整的DNA分子具有其不电泳期间迁移这样一个大的尺寸。 DNA断裂,但是,如果存在导致较小的片段中的电场移向阳极。更小的片段迁移更快。作为片段具有不同尺寸的电泳的最终结果是不是一个独特的线,而是以一个彗星的形状的连续体。该系统允许在小区中的DNA断裂的产生的“彗星”,从而对一个量化。
彗星试验最早是由瑞典科学家Ostling和约翰森1发达。的DNA是带负电荷的分子。电泳过程中,小,受损的DNA片段跑得更快走向带正电的阳极2。该DNA片段较小,向阳极更快的迁移,形成典型的“彗星”与“头”的完好,没有损坏DNA和一个“尾巴”受损的DNA片段3组成组成。受损DNA可以通过在主体4的不同机制,其保持DNA断裂相当平衡5的产生被修复。然而,如果平衡有利于DNA断裂,所述断裂会积聚并最终将有助于疾病的发展。
我们的DNA遭受约0.000165%的伤害,在给定的时间6。单链DNA断裂是指一个缺陷在DNA双螺旋的两条链中的一个而当DNA双螺旋的两条链被破坏双链DNA断裂引起的。有多种因素可促进DNA断裂在给定的时间量,如年龄细胞,香烟烟雾,各种药物或氧化胁迫7-9。如果导致增强的DNA断裂的所有因素保持不变,那么DNA断裂彗星试验的装置的定量是氧化应激的良好间接参数。
今天使用越来越多的医学眼科,包括彗星实验的方法。其中一个原因是,氧化应激是越来越多的认可作为发病机制各种疾病8-11和彗星试验是一种方法与氧化应激可以间接进行量化。
瑞典科学家Ostling和约翰松是第一个在自己的领域使用彗星试验来量化1细胞的DNA损伤。在中性条件下,这两个科学家使用,但是,只允许双链DNA断裂的检测。 Singh 等人后来适于测定使用在碱性条件下,这产生可能评估双和单链DNA断裂和检测碱不稳定的站点12中的敏感的版本。自其最初发展中,分析已修改在各种步骤以使其适用于评估类型在不同细胞类型13-15的DNA损伤。
与所有的技术,严格的支付重视技术细节是很重要的,以获得准确的结果16。根据我们的经验,得到最好的结果,如果每一个方法步骤,从溶液的制备彗星量化,通过专家的实验室进行TECHNicians。使用新鲜和正确准备的媒体,充足的移液技术,精确定时和(如前面的结果部分提到的)使用新鲜制备的白细胞为了裂解和凝胶电泳,以获得准确的结果至关重要的17。
在该试验中所有的各个步骤是为获得可靠的结果也同样重要。16在一般情况得到最好的结果,如果从溶液制备直到彗星量化每一个方法步骤是通过专家实验室technicians.Important执行似乎使用新鲜和正确地制备的培养基,充分移液技术,精确定时和如已经提到的结果部分的使用新鲜制备的白细胞为裂解和凝胶电泳以从测定17获得充分的效果。
由于做其他的方法,彗星试验技术都有其ADVAN每日新闻和缺点。作为一个敏感的方法,该法是脆弱的因素( 如紫外线),这可能增加DNA断裂,从而影响效果。时,应避免可增强氧化应激,不同之处在于它是正在研究的任何因素。压力可以增加氧化应激不仅白细胞,而且在所有其它血液媒介和淋巴细胞的水平。如前所述有许多不同的和更直接的测量氧化应激18,19的方法。彗星试验是许多方法具有一定的优势之一。这些包括其相对的低成本,小数目必需的(<10,000个细胞)的细胞和血液从而小样本每个病人所需的,时间的相对短的时间来量化细胞(约3天)的DNA损伤需要,其灵敏度和它的广泛的适用性,以在不同的细胞类型的驴的DNA损伤。在过去,我们选择与白细胞的工作,因为我们有经验,这细胞类型,它是适用于计划的具体研究。彗星测定法的另一个优点是,它可以用来检测不同类型和DNA损伤的水平,从而可以在研究其它各种领域之外的氧化应激,如DNA修复的研究中,补充试验或基因毒性研究应用。
氧化应激是目前公认的演奏在多种疾病的发病机理中起关键作用。彗星试验方法,同时测量氧化应激18,19的许多方法之一,是比较简单的,多功能的,价格低廉。当掌握,这种方法可以在医学的各个领域中,氧化应激作用8-10,20,21使用。
The authors have nothing to disclose.
我们想感谢LHW基金会,特里森列支敦士登,为支持经济我们的研究氧化应激。
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Qualigens | (CPW59) | |
Disodium EDTA | HiMedia | (RM1370) | |
Ethidium Bromide | Sigma | (E-8751) | |
Histopaque | Sigma | (1077-1) | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) | HiMedia | (TS1006) | |
Sodium Chloride (NaCl) | Ranbaxy Rankem | (S0160) | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | BDH-Merck | (89021) | |
Triton X-100 | HiMedia | (RM 845) | |
Trizma Base | Spectrochem | ||
Materials required for gel electrophoresis | |||
Normal Melting Agarose (NMA) | HiMedia | (RM273) | |
Low Melting Point Agarose (LMPA) | Sigma | (A9414) | |
Methanol – Qualigens | |||
Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) | Blue Star | ||
Microcentrifuge Tubes | Tarsons | (500010) | |
Micropipettor and Tips | Tarsons | ||
Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides |