Комета анализ измеряет разрывы ДНК, индуцированных различными факторами. Если все эти факторы (за исключением окислительного стресса), вызывающие повреждение ДНК поддерживаются постоянными, количество повреждений ДНК является хорошим косвенным показателем оксидативного стресса. Цель этого протокола заключается в использовании кометы анализа для косвенного измерения окислительного стресса.
Высших эукариот не могут жить без кислорода; Тем не менее, как это ни парадоксально, кислород может быть вредным для них. Молекула кислорода химически относительно инертны, потому что он имеет два неспаренных электронов, расположенных в разных р * Anti-связывающих орбиталей. Эти два электрона имеют параллельные спины, означает, что они вращаются в одном направлении вокруг собственных осей. Поэтому молекулы кислорода не очень реактивной. Активация кислорода может происходить по двум различным механизмам; либо за счет сокращения через одного электрона в момент времени (снижение) одновалентного или через поглощения энергии, достаточной, чтобы изменить спин одного из неспаренных электронов. Это приводит к продукции активных окислительных видов (ROS). Есть несколько способов, в которых человеческое тело устраняет ROS в физиологическом состоянии. Если АФК превышает емкость ремонт, окислительные результаты стресс и повреждения различных молекул. Есть много различных методов, с помощью которых окислительный стресс может быть мнеasured. Эта рукопись фокусируется на одном из методов, названных клеток гель-электрофорез, также известный как "кометы" анализа, который позволяет измерять разрывов ДНК. Если все факторы, как известно, вызывают повреждение ДНК, кроме окислительного стресса остаются постоянными, количество повреждений ДНК измеряли комет является хорошим показателем оксидативного стресса. Принцип прост и основывается на том, что молекулы ДНК отрицательно заряженной. Нетронутыми молекула ДНК имеет такой большой размер, чтобы он не мигрировать при электрофорезе. Разрывы ДНК, тем не менее, если они присутствуют в результате более мелкие фрагменты, которые перемещаются в электрическом поле к аноду. Небольшие фрагменты мигрируют быстрее. Как фрагменты имеют различные размеры конечный результат электрофореза не отличается линия, а континуум с формой кометы. Система позволяет количественно определить в результате "Комета" и, таким образом, из разрывов ДНК в клетке.
Комет была впервые разработана шведскими учеными Остлинг и Йохансон 1. ДНК отрицательно заряженные молекулы. Во время электрофореза мелкие, поврежденные фрагменты ДНК движутся быстрее в сторону положительно заряженному аноду 2. Меньше фрагменты ДНК, быстрее их миграция к аноду, образуя характерный «комету» с «головы», состоящей из целой, неповрежденной ДНК и "хвост", состоящий из поврежденных фрагментов ДНК 3. Поврежденные ДНК могут быть устранены путем различных механизмов в организме 4, которые держат поколение разрывов ДНК достаточно сбалансированным 5. Если, однако, баланс в пользу разрывов ДНК, разрывы могут накапливаться и в конечном счете, будет способствовать развитию заболевания.
Наша ДНК страдает примерно 0.000165% урона в данный момент времени 6. Одноцепочечной разрывы ДНК см дефекта на одном из двух нитей двойной спирали ДНКв то время как двухцепочечные разрывы ДНК возникают, когда обе нити двойной спирали ДНК повреждены. Существуют различные факторы, которые могут увеличить количество разрывов ДНК в данный момент времени, такие как возраст клетки, сигаретного дыма, различных препаратов или окислительным стрессом 7-9. Если все факторы, ведущие к повышенной разрывов ДНК остаются постоянными, то количественное определение разрывов ДНК с помощью комет является хорошим косвенным показателем оксидативного стресса.
Метод комет чаще используется сегодня в медицине, включая офтальмологии. Одной из причин этого является то, что окислительный стресс является более признается в качестве патогенетической механизма для различных заболеваний и 8-11 комет является одним из методов, с которой окислительный стресс косвенно может быть определена количественно.
Шведские ученые Остлинг и Йохансон были первыми в своей области, чтобы использовать кометы анализа количественно повреждение ДНК в клетках 1. В нейтральных условиях, что две ученые использовали, однако, разрешено только обнаружение двухцепочечных разрывов ДНК. Сингх и др. Позже адаптирована для анализа для использования щелочных условиях, который произвел чувствительный вариант, который может оценивать двухместные и одноцепочечной разрывы ДНК и выявления щелочно-лабильные сайты 12. С момента своего первоначального развития, анализ был изменен на различных этапах, чтобы сделать его пригодным для оценки типов повреждений ДНК в различных типах клеток 13-15.
Как и со всеми методами, обращая строгое внимание на технические детали важно для получения точных результатов 16. Основываясь на нашем опыте, наилучшие результаты получаются, если каждый методологический шаг от приготовления раствора до кометы количественное-осуществляется экспертной лаборатории технicians. Использование свежей и правильно подготовленной информации, адекватных методов пипеток, точного времени и (как уже упоминалось ранее в разделе результатов) с использованием свежеприготовленных лейкоцитов необходимы для того, чтобы лизиса и электрофореза в геле, чтобы получить точные результаты 17.
Все отдельные шаги в этом анализе одинаково важны для получения достоверных результатов. 16 В целом лучшие результаты получаются, если каждый методологический шаг от приготовления раствора до кометы количественного осуществляется экспертной лаборатории technicians.Important кажется использование свежих и правильно подготовленных СМИ адекватные методы пипетки, точные сроки и, как уже говорил в разделе результатов использования свежеприготовленных лейкоцитов для лизиса и гель-электрофореза для получения адекватных результатов от анализа 17.
Как и другие методологии, комета техника тест имеет свою AdvanTages и недостатки. Будучи чувствительным методом, анализ уязвима для факторов (например, УФ-светом), которые можно было бы повысить разрывы ДНК и, таким образом, влияют на результаты. Любой фактор, который может усиливать окислительный стресс, за исключением того, что в настоящее время исследованы, следует избегать. Стресс может увеличить уровень окислительного стресса не только в лейкоцитах, но и во всех других средах крови и лимфоцитов. Как уже упоминалось ранее, существует много различных и более прямые способы измерения окислительного стресса 18,19. Комет является одним из многих методов, которые имеет определенные преимущества. Они включают в себя его относительно низкую стоимость, небольшое количество клеток, необходимых (<10000 клеток) и, таким образом небольшие образцы крови, необходимые на пациента, в относительно короткий период времени, необходимый для количественного повреждение ДНК в клетках (приблизительно 3 дня), его чувствительность и его широкое распространение применимость к повреждению ДНК ослов в различных клеточных типов. В прошлом мы решили работать с лейкоцитами, так как мы имели опыт с этимтипа клеток, и это было применимо для конкретного исследования планировалось. Еще одно преимущество кометы анализа является то, что он может быть использован для обнаружения различных типов и уровней повреждений ДНК и, таким образом, может применяться в различных других областях исследований, кроме окислительного стресса, таких как репарации ДНК исследований, испытаниях добавок или генотоксичность исследований.
Окислительный стресс в настоящее время признается играет решающую роль в патогенезе нескольких заболеваний. Метод комет, в то время как один из многих способов измерения оксидативного стресса 18,19, является относительно простым, универсальным и недорого. Когда освоил, этот метод может быть использован во всех областях медицины, в котором окислительный стресс играет роль 8-10,20,21.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить LHW Stiftung, в Тризен Лихтенштейна, финансовую поддержку наших исследований на окислительный стресс.
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Qualigens | (CPW59) | |
Disodium EDTA | HiMedia | (RM1370) | |
Ethidium Bromide | Sigma | (E-8751) | |
Histopaque | Sigma | (1077-1) | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) | HiMedia | (TS1006) | |
Sodium Chloride (NaCl) | Ranbaxy Rankem | (S0160) | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | BDH-Merck | (89021) | |
Triton X-100 | HiMedia | (RM 845) | |
Trizma Base | Spectrochem | ||
Materials required for gel electrophoresis | |||
Normal Melting Agarose (NMA) | HiMedia | (RM273) | |
Low Melting Point Agarose (LMPA) | Sigma | (A9414) | |
Methanol – Qualigens | |||
Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) | Blue Star | ||
Microcentrifuge Tubes | Tarsons | (500010) | |
Micropipettor and Tips | Tarsons | ||
Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides |