يقيس الفحص المذنب فواصل DNA، الناجم عن عوامل مختلفة. إذا يتم الاحتفاظ جميع العوامل (باستثناء الاكسدة) مما تسبب في أضرار الحمض النووي المستمر، وكمية من الحمض النووي من التلف معلمة جيدة غير المباشرة من الاكسدة. والهدف من هذا البروتوكول هو استخدام مقايسة المذنب لقياس غير مباشر من الإجهاد التأكسدي.
كائنات حقيقية النواة أعلى لا يمكن ان يعيش بدون أكسجين؛ بعد، للمفارقة، الأكسجين يمكن أن تكون ضارة لهم. جزيء الأكسجين كيميائيا خامل نسبيا لأنه يحتوي على اثنين من الإلكترونات المفردة تقع في مختلف المدارات بي * مكافحة الترابط. هذه الالكترونات لهما يدور موازية، وهذا يعني أنها تدور في نفس الاتجاه حول المحاور الخاصة بهم. هذا هو السبب في أن جزيء الأكسجين ليس رد الفعل جدا. قد تحدث تفعيل الأوكسجين من قبل اثنين من آليات مختلفة. إما عن طريق تخفيض عبر إلكترون واحد في (خفض أحادي التكافؤ) مرة، أو عن طريق امتصاص الطاقة كافية لعكس اتجاه دوران واحد من الإلكترونات المفردة. وهذا يؤدي إلى إنتاج الأنواع المؤكسدة رد الفعل (ROS). هناك عدد من الطرق التي يمكن للجسم البشري يلغي ROS في حالته الفسيولوجية. إذا تجاوز إنتاج ROS القدرة إصلاح، والنتائج الاكسدة والأضرار جزيئات مختلفة. هناك العديد من الطرق المختلفة التي الاكسدة يمكن أن يكون ليasured. وتركز هذه المخطوطة على إحدى الطرق اسمه الكهربائي هلام الخلية، والمعروفة أيضا باسم "مقايسة المذنب" الذي يسمح بقياس فواصل DNA. إذا يتم الاحتفاظ جميع العوامل المعروفة يسبب التلف في الحمض النووي، وغيرها من الاكسدة المستمر، وكمية من الحمض النووي من التلف تقاس مقايسة المذنب هو معلمة جيدة من الاكسدة. مبدأ بسيط ويعتمد على حقيقة أن جزيئات DNA وسالبة الشحنة. جزيء DNA سليمة لديه مثل حجم كبير أنه لا تهاجر خلال الكهربائي. فواصل DNA، ولكن، إذا كانت النتيجة الحالية في أجزاء أصغر والتي تتحرك في مجال كهربائي نحو القطب الموجب. شظايا أصغر تهاجر أسرع. كما شظايا وأحجام مختلفة النتيجة النهائية للالكهربي ليست خط واضح بل سلسلة متصلة مع شكل مذنب. النظام يسمح لتقدير حجم الناتج "المذنب" وبالتالي فواصل DNA في الخلية.
وقد وضعت مقايسة المذنب أول مرة من قبل علماء سويديون أوستلينج وجوهانسون 1. الحمض النووي هو جزيء سالبة الشحنة. خلال الكهربائي، أصغر، شظايا الحمض النووي التالف السفر أسرع نحو القطب الموجب موجبة الشحنة +2. أصغر شظايا الحمض النووي، وأسرع هجرتها نحو القطب الموجب لتشكيل "المذنب" نموذجي مع "الرأس" تتألف من حالها، DNA التالفة و "ذيل" مؤلفة من شظايا الحمض النووي التالف 3. يمكن اصلاحها الحمض النووي التي تضررت من الآليات المختلفة في الجسم 4، والتي تبقي توليد فواصل DNA متوازنة إلى حد ما 5. إذا، ومع ذلك، فإن التوازن هو في صالح فواصل DNA، يمكن فواصل تتراكم وسوف تسهم في نهاية المطاف إلى تطور المرض.
DNA لدينا يعاني حوالي 0.000165 الضرر٪ في وقت معين 6. فواصل الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل واحدة تشير إلى وجود خلل في واحد من اثنين من خيوط الحلزون المزدوج DNAبينما هي سبب فواصل الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل عند تلف كل من خيوط الحلزون المزدوج DNA. هناك العديد من العوامل التي قد تعزز كمية فواصل DNA في وقت معين مثل عمر الخلية، ودخان السجائر، الأدوية المختلفة أو الإجهاد التأكسدي 7-9. إذا وتحفظ كل العوامل التي تؤدي إلى فواصل DNA تعزيز المستمر، ثم القياس الكمي للفواصل DNA عن طريق فحص المذنب هو معلمة جيدة غير المباشرة من الاكسدة.
يتم استخدام طريقة الفحص المذنب على نحو متزايد اليوم في الطب بما في ذلك طب العيون. وأحد أسباب ذلك هو أن الاكسدة هو المزيد والمزيد من الاعتراف كآلية إمراضي لمختلف الأمراض 8-11 ومقايسة المذنب هو أسلوب واحد التي الأكسدة الإجهاد يمكن أن يكون كميا بشكل غير مباشر.
كان علماء سويديون أوستلينج وجوهانسون الأولى من نوعها في مجال عملهم لاستخدام مقايسة المذنب لتحديد الحمض النووي من التلف في الخلايا 1. شروط محايدة اثنين من العلماء تستخدم، ولكن فقط يسمح للكشف عن فواصل الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل. سينغ وآخرون. تكييفها في وقت لاحق مقايسة للاستخدام تحت الظروف القلوية، التي أنتجت نسخة الحساسة التي يمكن تقييم فواصل الحمض النووي المزدوج والمفرد الذين تقطعت بهم السبل وكشف مواقع القلويات عطوب 12. منذ تطوره الأولية، تم تعديل مقايسة على الخطوات المختلفة لجعلها مناسبة لتقييم أنواع من الحمض النووي من التلف في أنواع مختلفة من الخلايا 13-15.
كما هو الحال مع جميع التقنيات، مع إيلاء اهتمام دقيق إلى التفاصيل الفنية المهم للحصول على نتائج دقيقة 16. بناء على خبرتنا، ويتم الحصول على أفضل النتائج إذا كل خطوة من إعداد المنهجية حل لالمذنب والكمي التي يقوم بها المختبر ميتاليك الخبراءicians. استخدام وسائل الإعلام الجديدة واستعداد بشكل صحيح، وتقنيات pipetting لالكافية، والتوقيت الدقيق و(كما ذكر سابقا في قسم النتائج) استخدام الطازجة الكريات البيض ضرورية من أجل تحلل وهلام الكهربائي للحصول على نتائج دقيقة 17.
كل الخطوات الفردية في هذا الاختبار هي نفس القدر من الأهمية للحصول على نتائج موثوقة. 16 وفي أفضل النتائج العامة ويتم الحصول على إذا يتم تنفيذ كل خطوة منهجية واحدة من إعداد حل حتى الكمي المذنب خبير technicians.Important مختبر ويبدو أن استخدام وسائل الإعلام الجديدة ومستعدة بشكل صحيح والتقنيات pipetting لكافية، التوقيت الدقيق وكما سبقت الإشارة إليه في القسم نتائج استخدام الكريات البيض الطازج للتحلل وهلام الكهربائي للحصول على نتائج كافية من فحص 17.
كما يفعل منهجيات أخرى، وتقنية الفحص المذنب لديها يمضي بهاتاغس وعيوب. كونها طريقة حساسة، وفحص عرضة لعوامل (على سبيل المثال، وعلى ضوء الأشعة فوق البنفسجية) والتي يمكن أن تزيد فواصل DNA وبالتالي تؤثر على النتائج. أي العوامل التي قد تعزز الاكسدة، باستثناء تلك التي يجري بحثها، ينبغي تجنبها. يمكن الضغوطات زيادة مستوى الإجهاد التأكسدي ليس فقط في الكريات البيض ولكن أيضا في جميع وسائل الدم وغيرها من الخلايا الليمفاوية. كما ذكر في وقت سابق أن هناك العديد من الطرق المختلفة وأكثر مباشرة لقياس الإجهاد التأكسدي 18،19. مقايسة المذنب هو واحد من العديد من الطرق التي لديها بعض المزايا. وتشمل هذه تكلفته النسبية منخفضة، وعدد قليل من الخلايا المطلوبة (<10000 الخلايا) وبالتالي عينات صغيرة من الدم المطلوبة لكل مريض، وخلال فترة قصيرة نسبيا من الوقت اللازم لتحديد الحمض النووي من التلف في الخلايا (حوالي 3 أيام)، حساسيته ولها اسعة الانتشار تطبيقها على الحمض النووي من التلف الحمير في مختلف أنواع الخلايا. في الماضي نختار للعمل مع الكريات البيض منذ كان لدينا تجربة مع هذاكان من نوع الخلية وذلك ينطبق على دراسة معينة المخطط لها. ميزة أخرى للمقايسة المذنب هو أنه يمكن استخدامها للكشف عن أنواع ومستويات الحمض النووي من التلف المختلفة، وبالتالي يمكن تطبيقها في مناطق أخرى مختلفة من الدراسات إلى جانب الاكسدة مثل دراسات إصلاح الحمض النووي، والتجارب مكملات أو دراسات السمية الوراثية.
يتم الاعتراف الاكسدة الآن كما لعب دورا حاسما في التسبب في أمراض متعددة. طريقة الفحص المذنب، في حين أن أحد طرق عديدة لقياس الإجهاد التأكسدي 18،19، هو بسيط نسبيا، وتنوعا وغير مكلفة. عندما يتقن، وهذه الطريقة يمكن استخدامها في جميع مجالات الطب التي الاكسدة يلعب دورا 8-10،20،21.
The authors have nothing to disclose.
نود أن نشكر LHW ستيفتونغ، في تريزين ليختنشتاين، لدعم ماليا أبحاثنا على الاكسدة.
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Qualigens | (CPW59) | |
Disodium EDTA | HiMedia | (RM1370) | |
Ethidium Bromide | Sigma | (E-8751) | |
Histopaque | Sigma | (1077-1) | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) | HiMedia | (TS1006) | |
Sodium Chloride (NaCl) | Ranbaxy Rankem | (S0160) | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | BDH-Merck | (89021) | |
Triton X-100 | HiMedia | (RM 845) | |
Trizma Base | Spectrochem | ||
Materials required for gel electrophoresis | |||
Normal Melting Agarose (NMA) | HiMedia | (RM273) | |
Low Melting Point Agarose (LMPA) | Sigma | (A9414) | |
Methanol – Qualigens | |||
Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) | Blue Star | ||
Microcentrifuge Tubes | Tarsons | (500010) | |
Micropipettor and Tips | Tarsons | ||
Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides |