혜성 분석은 다른 요인에 의해 유도 된 DNA 나누기를 측정한다. DNA 손상을 유발 (산화 스트레스를 제외한) 모든 요인들이 일정하게 유지되는 경우, DNA 손상의 양이 산화 스트레스 좋은 간접 파라미터이다. 이 프로토콜의 목적은 산화 적 스트레스의 간접적 인 측정에 혜성 분석을 사용하는 것이다.
산소없이 살 수없는 높은 진핵 생물; 그러나 역설적으로, 산소는 그들에게 해가 될 수 있습니다. 그것이 다른 파이 * 고결 궤도에있는 두 개의 비공유 전자를 가지고 있기 때문에, 산소 분자는 화학적으로 비교적 불활성이다. 이 두 전자들은 자신의 축에 대한 동일 방향으로 회전 즉, 평행 한 스핀을 갖는다. 산소 분자가없는 매우 반응성 이유이다. 산소의 활성화는 두 개의 서로 다른 메커니즘에 의해 발생할 수 있습니다; 어느 시간 (가의 감소)를 통해 하나의 전자 환원을 통해, 또는 충분한 에너지의 흡수를 통해 부대 전자 중 하나의 회전을 반대로. 이것은 반응성 산화 화학 종 (ROS)의 생성을 초래한다. 인체 생리 학적 상태에서 ROS를 제거하는 여러 가지 방법이있다. ROS 생성은 보수 능력, 산화 스트레스의 결과 및 다른 손상 분자를 초과하는 경우. 산화 스트레스는 저를 할 수있는 여러 가지 방법이 있습니다asured. 이 논문은 또한 DNA 나누기의 측정을 허용한다 "혜성 분석법"로 알려진 세포 겔 전기 영동,라는 방법 중 하나에 초점을 맞춘다. 산화 스트레스 이외의 DNA 손상을 유발하는 것으로 알려진 모든 요인들이 일정하게 유지되는 경우, 혜성 분석법에 의해 측정 된 DNA 손상의 양이 산화 스트레스 좋은 파라미터이다. 원리는 간단하며, DNA 분자가 음으로 하전된다는 사실에 의존한다. 완전한 DNA 분자는 전기 영동시 이동하지 않도록 큰 크기를 갖는다. DNA 나누기 그러나 양극쪽으로 전계 이동 작은 단편으로 존재하는 경우 결과. 작은 조각 빠르게 이동한다. 단편은 서로 다른 크기를 가지고 전기의 최종 결과는 별개 라인 오히려 혜성의 형상으로 연속이 아니다. 시스템은 세포의 DNA 나누기 얻어진 "혜성"및 이와의 정량을 허용한다.
혜성 분석은 처음 스웨덴어 과학자 Ostling 및 요한슨 (1)에 의해 개발되었다. DNA는 음전하 분자이다. 전기 영동시, 작은 손상, DNA 단편을 빠르게 양전하 양극 (2)을 향해 이동한다. DNA 단편 작을 양극쪽으로 빠르게 자신 마이그레이션 손상, DNA 손상과 손상된 DNA 단편 (3)으로 이루어지는 "꼬리"구성된 "헤드"전형적인 "혜성"을 형성한다. 손상된 DNA를 5 매우 균형 잡힌 DNA 나누기의 생성을 유지 본체 (4) 다른 메커니즘에 의해 복구 할 수 있습니다. 그러나, 저울이 DNA 바꿈 대신 경우 나누기 쌓일 수 궁극적 질환의 발전에 기여한다.
우리의 DNA는 주어진 시간 6 약 0.000165 % 손상을 겪고있다. 단일 가닥 DNA 나누기는 DNA 이중 나선의 두 가닥 중 하나에 결함 참조DNA 이중 나선의 두 가닥이 손상되면 이중 가닥 DNA 나누기가 발생하는 반면. 이러한 세포의 연령, 담배 연기, 다양한 약물 또는 산화 스트레스 7-9으로 주어진 시간에 DNA 나누기의 양을 향상시킬 수있다 여러가지 요인이있다. 향상된 DNA 파손으로 이어지는 모든 요인들이 일정하게 유지된다면, 혜성 분석법에 의해 DNA 나누기 부량은 산화 스트레스 좋은 간접 파라미터이다.
혜성 분석의 방법을 포함한 안과 의학에서 점점 오늘날 사용된다. 그 이유 중 하나는 산화 스트레스가 더욱 더 한 방법 간접적으로 정량 할 수있는 산화 스트레스와 각종 질병 8-11 및 혜성 분석 용기구 병인으로 인식한다는 것이다.
스웨덴어 과학자 Ostling 및 요한슨은 세포 하나에서 DNA 손상을 정량화하는 혜성 분석을 사용하여 자신의 분야에서 처음이었다. 중성 조건은 두 과학자들이 사용한다는 점만을 이중 가닥 DNA 나누기의 검출을 허용했다. 싱 등은. 나중에 단일 및 이중 가닥 DNA 나누기를 평가하고 알칼리 불안정한 사이트 (12)을 감지 할 수있는 민감한 버전을 생산 알칼리 조건에서 사용하기위한 분석을 적용. 초기 개발 이후, 분석은 상이한 세포 유형에서 13-15 DNA 손상의 유형을 평가하기에 적합하도록 다양한 단계에서 수정되었다.
모든 기술에서와 같이, 기술 정보에 엄격한주의를 기울이지 16 것은 정확한 결과를 얻기 위해 중요하다. 우리의 경험을 바탕으로 최상의 결과를 얻을 경우 모든 방법 론적 스텝에서 정량-되는 전문 실험실 TECHN에 의해 혜성 수행에 솔루션 준비icians. 신선하고 정확하게 준비된 용지 적절한 피펫 기법 정확한 타이밍과 새로 제조 한 백혈구 (이전 결과 섹션에서 언급 된 바와 같이)의 사용 용도는 정확한 결과 (17)를 얻기 위해 분해 및 겔 전기 영동을 위해서는 필수적이다.
이 분석에서 모든 개별 단계는 신뢰할 수있는 결과를 얻기위한 동등하게 중요하다. 일반적으로 가장 좋은 결과에서 (16)를 얻을 수있다 혜성 정량화까지 솔루션 준비에서 매 방법 론적 단계는 전문 실험실 technicians.Important에 의해 수행되는 경우 것 같다 신선하고 제대로 준비 미디어의 사용 적절한 피펫 기법, 정확한 타이밍은 이미 결과 분석 부 (17)로부터 적절한 결과를 얻기 위해 분해 및 겔 전기 영동 새로 제조 한 백혈구 사용 함.
다른 방법을 할 때, 혜성 분석 기술은 ADVAN이의 tages과 단점. 민감한 방법이기 때문에, 분석은 DNA 휴식을 증가 때문에 결과에 영향을 미칠 수있는 요소 (예를 들면, 자외선)에 취약합니다. 연구되고있는 것을 제외하고, 산화 스트레스를 향상시킬 수있다 상관 계수는 피해야한다. 스트레스는 산화 스트레스 백혈구에서뿐만 아니라 다른 모든 혈액 매체와 림프구에서뿐만 아니라의 수준을 높일 수 있습니다. 앞서 언급 한 바와 같이 산화 스트레스 18,19 측정 다양한 더 직접적인 방법이있다. 혜성 분석은 어떤 장점이 많은 방법 중 하나입니다. 이들은 상대적 저비용 (<10,000 세포)에 필요한 세포의 수가 적은 환자 당 필요한 피 따라서 작은 시료 세포 (약 3 일간)에서 DNA 손상을 계량하는 데 필요한 시간의 상대적인 짧은 기간, 그 감도를 포함 서로 다른 세포 유형에서 엉덩이의 DNA 손상에 넓은 확산 적용. 우리는이 경험을 가지고 있기 때문에 과거에 우리는 백혈구와 함께 작동하도록 선택세포 형과 계획, 특정 연구에 적용했다. 혜성 분석법의 또 다른 장점은 서로 다른 유형 및 DNA 손상의 레벨을 검출하는데 사용될 수 있으며, 따라서 이러한 DNA 복구 과정, 보충 실험 또는 유전 독성 연구와 같은 산화 적 스트레스 또한 연구의 다양한 분야에 적용 할 수 있다는 것이다.
산화 스트레스는 이제 여러 질환의 발병 기전에서 중요한 역할을 인식한다. 혜성 분석 방법은 산화 스트레스 18,19 측정 많은 방법 중 하나를하면서, 비교적 간단하고 저렴한 다재다능하다. 습득하면,이 방법은 산화 스트레스가 역할을 담당 8-10,20,21되는 의학의 모든 분야에서 사용될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 재정적으로 산화 스트레스에 우리의 연구를 지원하기 위해, 트리 젠 리히텐슈타인, LHW 재단에게 감사의 말씀을 전합니다.
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Qualigens | (CPW59) | |
Disodium EDTA | HiMedia | (RM1370) | |
Ethidium Bromide | Sigma | (E-8751) | |
Histopaque | Sigma | (1077-1) | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) (Ca++, Mg++ free) | HiMedia | (TS1006) | |
Sodium Chloride (NaCl) | Ranbaxy Rankem | (S0160) | |
Sodium Hydroxide (NaOH) | BDH-Merck | (89021) | |
Triton X-100 | HiMedia | (RM 845) | |
Trizma Base | Spectrochem | ||
Materials required for gel electrophoresis | |||
Normal Melting Agarose (NMA) | HiMedia | (RM273) | |
Low Melting Point Agarose (LMPA) | Sigma | (A9414) | |
Methanol – Qualigens | |||
Coverslips (No. 1, 24 x 60 mm) | Blue Star | ||
Microcentrifuge Tubes | Tarsons | (500010) | |
Micropipettor and Tips | Tarsons | ||
Microscope Slides, Conventional / Micro gel electrophoresis (MGE) slides |